Структурная и функциональная характеристика маннан-связывающего лектина морского ежа Strongylocentrotus nudus

• Автор: Шамшурина, Екатерина Валерьевна
• Шифр специальности: 03.03.04, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 103 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2. 1. Классификация зоолектинов

2.2. Функции лектинов

2.3. Участие лектинов в процессах морфогенеза

2. 4. Маннансвязывающие лектины.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3. 1. Материал.

3. 2. Приготовление целомической жидкости

3. 3. Реакция прямой гемагглютинации РГТГА.

3. 4. Ингибирование РИГА.
3. 5. Определение зависимости активности МСЛ8КТ от температуры
3. 6. Определение зависимости активности Л от
3. 7. Определение зависимости активности МСЛ8И от концентрации
ионовСа2 вереде.
3. 8. Выделение МСЛЗЫ.
3.8. 1. Ионообменная хроматография.
3. 8. 2. Аффинная хроматорафия
3. 8. 3. Гельфильтрация
3. 9. Получение антисыворотки и АТМСЛЯЫ.
3. . Получение конъюгатов АТМСЛ8Ы с 1ТГС
3. . ДСНПААГэлектрофорез.
3. . Вестернблот анализ МСЛ8И
3. . Установление первичной структуры МСЛ8Ы.
3. . 1. Выделение РНК и синтез кДПК
3. . 2. Клонирование и секвенирование кДНК.
3. . Иммуноцитохимическое выявление МСЛБИ в личинках и тканях 5.
3. . 1. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание срезов тканей .
3. . 2. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание мазков
целомоцитов .
3. . 3. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание полутонких и
улыратонких срезов
3. . 4. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание
гистологических срезов и прижизненное прямое иммунофлуоресцентное окрашивание эмбрионов и личинок .
3. . Исследование влияния МСЛ на фагоцитарную активность целомоцитов . в условиях i vi
3. . Исследование влияния 1 на ранний онтогенез морского ежа
.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4. 1. Выделение I из целомической жидкости . .
4.2. Определение молекулярной массы и субъсдиничного состава
4. 3. Углеводная специфичность I
4. 4. Зависимость активности МСЛ от концентрации ионов Са , и
температуры.
4. 5. Установление первичной структуры МСЛ.
4. 6. Локализация МСЛ в тканях .
4. 7. Влияние МСЛ на фагоцитарную активность целомоцитов . i vi
4. 8. Электрофоретическое выявление МСЛ в эмбрионах и личинках
5.
4. 9. Локализация МСЛ в личинках .
4. . Влияние МСЛ и его лигандов на ранний онтогенез морского ежа
5.
5. ОБСУЖДЕНИЕ
5. 1. Физикохимические свойства
5. 2. Аминокислотная последовательность и предсказанная
пространственная структура молекулы 1.
5. 3. Локализация МСЛ в органах и тканях .
5. 4. Участие МСЛ в защитных реакциях
5. 5. Участие МСЛ в раннем онтогенезе . .
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Локализация МСЛ в тканях . Влияние МСЛ на фагоцитарную активность целомоцитов . Локализация МСЛ в личинках . 1. Локализация МСЛ в органах и тканях . Участие МСЛ в раннем онтогенезе . ВЫВОДЫ. ДСНПААГэлектрофорез электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия кДНК комплементарная ДНК м. Л маннансвязывающий лектин АроьйсЪортаротст МСЛС. Сиситагтаротса МСЛБК маннансвязывающий лектин пи1т ОФДА ортофенилендиамии п. ПарФБ 4 параформ с добавлением 0. ТБ буферный раствор, содержащий 0. М ТрисНС1, 7. ТБСа2 буферный раствор, содержащий 0. М ТрисНС1, 7. ТБС буферный раствор, содержащий 0. М ТрисИС1, 7. ТБССа буферный раствор, содержащий 0. М ТрисНО, 7. ТБСТ буферный раствор, содержащий 0. М ТрисНС1, 7. ФБСТ фосфатносолевой буфер, содержащий 0. искусственная морская вода без добавления ионов Са и . Лектины это обширный класс белков, обладающих общим свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры Королев, . На данный момент лектины обнаружены у организмов, находящихся на разных ступенях эволюции, начиная от наиболее примитивных форм жизни вирусов и бактерий до представителей высших позвоночных, что свидетельствует об эволюционной древности и универсальности механизмов, основанных на белокуглеводном распознавании. Известно, что лектины принимают участие во многих биологических процессах, таких как оплодотворение, развитие, миграция клеток, апоптоз и т. 1, Т2ягду . Важную роль играют лектины в реакциях конститутивного или врожденного иммунитета. Являясь составной частью иммунитета позвоночных, лектины осуществляют немедленную, в отличие от системы адаптивного иммунитета, реакцию на инфекцию или повреждение. Наиболее изученными лектинами, выполняющими барьерную функцию, являются лектины Стипа, и, в частности, маннансвязывающие лектины МСЛ, относящиеся к коллектинам. Исследована структура молекулы МСЛ и установлено наличие в ней консервативного участка, ответственного за связывание с углеводами углеводраспознающего домена и эффекторного коллагеноподобного домена. Установлено, что МСЛ в комплексе с сериновыми протеазами участвуют в активации системы комплемента по лектиновому пути ТЬеа1 е1 а1. КиЫтап е1 а1. У представителей беспозвоночных животных структура и функции МСЛ исследованы значительно меньше, чем у позвоночных, несмотря на то, что данные лектины обнаружены как у первичноротых коралловые полипы, моллюски, ракообразные, насекомые, так и у вторичноротых животных иглокожие, низшие хордовые асцидии, ланцетник. Поэтому, исследование системы неспецифического иммунитета беспозвоночных, в частности МСЛ, имеет большое значение для понимания процесса формирования и становления функций этого компонента защитной системы в эволюции . Для развития эволюционных представлений актуальны исследования, выполненные на иглокожих примитивных, близких к предковым формам, представителях вторичноротых животных. Иглокожие являются классическим экспериментальным объектом для работ в области биологии развития и сравнительной иммунологии. Ранее у двух представителей голотурий i i и i i были обнаружены и охарактеризованы МСЛ, гомологичные МСЛ позвоночных Булгаков и др. v . Исследована биологическая активность этих лектинов, их роль в иммунной защите. Кроме того, показано, что МСЛ А. В серии предварительных исследований показано наличие лектинной активности целомической жидкости морского ежа по отношению к маннанам полисахаридам, построенным из остатков маннозы. Цель и задачи работы. Целью работы явилось исследование структуры, физикохимических свойств, роли в защитных реакциях и эмбриогенезе нового лектина, выделенного из целомической жидкости морского ежа . МСЛ вероятного гомолога маннансвязывающих лектинов позвоночных.