Генетическая трансформация половых клеток кроликов и хряков с использованием ретровирусных векторов

• Автор: Лоцманова, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.07, 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Дубровицы
• Количество страниц: 102 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Процесс формирования мужских половых клеток

Стадии сперматогенеза у млекопитающих

Типы клеток сперматогениого эпителия.

Использование половых клеток для получения трансгенных животных.

Использования спермисв для переноса рекомбинантной ДНК в клеткимишени

Трансплантация сперматогоний.

Использования ретровирусных векторов для генетической трансформации половых клеток животных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы
Реактивы и оборудование
Генные конструкции.
Работа с культурой клеток
Культивирование клеток.
Получение первичной культуры клеток семенника кроликов и хряков.
Трансформация клетокмишеней ретровирусными векторами Трансформация культуры клеток семенников кроликов и
хряков i vi.
Введение ретровирусных векторов в семенники кроликов и хряков i viv
Анализ на наличие генной конструкции
Анализ экспрессии рекомбинантных белков.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Эффективность трансфекции клеток семенников кролика и хряка ретровирусными векторами в культуре i vi
Трансформация клеток семенников кролика i viv посредством прямого введения ретровирусных генных конструкций.
Введение в семенники кроликов генной конструкции .
Введение в семенники кроликов генных конструкций, содержащих кДНК инсулина человека.
Введение генных конструкций в клетки сперматогенного эпителия семенников хряков i viv
Введение в семенники хряков генной конструкции
Введение в семенники хряков генной конструкции XI .
Анализ факторов, влияющих на эффективность генетической трансформации сперматогеииых клеток семенников животных
Влияние генной конструкции на эффективность трансформации клетокмишеней
Влияние вида животного па эффективность интеграции рекомбинантной ДНК в сперматогенные клетки
Влияние дозы введения генной конструкции и способа подготовки генной консгрукции на эффективность переноса рекомбинантной ДНК в клеткимишени.
ВЫВОДЫ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
ЛИТЕРАТУРА


Актуальность темы. Разработка методов генетической модификации животных, основанных на использовании половых клеток в качестве векторов для переноса генов, рассматривается как альтернатива традиционному методу получения трансгенных животных микроинъекции ДНК в пронуклеус зигот Коржикова С. В., Савченкова И. П. и др. Новгородова И. П. и др. Эрнст Л. К. и др. Волкова Н. А. и др. Интерес к данному направлению связан, прежде всего, с природной способностью клеток сперматогенного эпителия самцов поглощать чужеродную ДНК чДНК и переносить ее в яйцеклетку посредством оплодотворения i . I8. При этом интегрированная в геном организма чДНК может устойчиво передаваться в ряде поколений. Ввиду проведения манипуляций навзрослых животных значительно сокращаются материальные и временные затраты на получение трансгенного потомства. Несмотря на то, что для трансформации половых клеток спермиев используют ряд методов липофекцию, электропорацию и вирусную трансдукцию, сегодня не разработаны системы, позволяющие эффективно доставлять рекомбинантную ДНК в данные клеткимишени. Разработка эффективного метода генетической модификации половых клеток позволит получить простой и удобный способ создания трансгенных животных, т. Одним из возможных путей решения данной проблемы является трансформация половых клеток на ранних стадиях их дифференцировки с использованием генных конструкций, полученных на основе рекомбинантных ретровирусов. Цель и задачи. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось изучение эффективности использования ретровирусных векторов для генетической трансформации половых клеток хряков и самцов кроликов. Изучить компетентность клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков к ретровирусным векторам i vi. Осуществить трансформацию клеток сперматогенного ряда прямым введением генных конструкций в семенники кроликов и хряков i viv. Определить факторы, влияющие на эффективность трансформации клеток сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков i viv кратность введения, концентрация и тип используемого препарата. Изучить результативность генетической трансформации сперматогенных клеток кроликов и свиней i viv генными конструкциями, содержащими кДНК инсулина человека. Исследовать характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках сперматогенного эпителия семенников кроликов и хряков. Научная новизна. Впервые исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия кроликов и хряков посредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток сперматогенного ряда i viv. Дана характеристика паттернов интеграции и экспрессии рекомбинантных генов , инсулин в половых клетках самцов кроликов и хряков. Практическая значимость. Оптимизированы условия введения ретровирусных векторов в органымишени отработан способ подготовки генных конструкций для инъекций и определена концентрация генных конструкций, эффективная для интеграции рекомбинантной ДНК в клетки сперматогенного эпителия. Показана способность трансформированных сперматогоний к дальнейшей дифференцировке. Доказано наличие рекомбинантной ДНК в сперм иях опытных животных по достижении ими половой зрелости. Опосредованный ретровирусами перенос генов как способ генетической трансформации клеток сперматогенного ряда i vi и i viv. Характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках сперматогенного эпителия кроликов и хряков. Апробация работы. Уфа, г. Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии. Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК Достижения науки и техники АПК, Сельскохозяйственная биология 2. Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит таблиц и рисунков. Библиографический список включает 1 источников, в том числе 1 на иностранных языках.