Эффективность использования ретровирусных векторов для генетической трансформации клеток яйцевода кур in vivo

• Автор: Белоглазов, Денис Валерьевич
• Шифр специальности: 03.02.07, 03.03.01
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: п. Дубровицы Московской обл.
• Количество страниц: 101 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Органы размножения самок птиц

1.2 Образование яйца в половых органах курицы.

1.3 Микроструктура слизистой оболочки белкового отдела

яйцевода i

1.3.1 Бакаловидные клетки.

1.3.2 Реснитчатые клетки

1.3.3 Трубчатые железы

1.4 Синтез секрета в клетках слизистой оболочки белкового

отдела яйцевода птиц.
1.5 Формирование яйца.
1.6 Получение трансгенной сельскохозяйственной птицы
1.7 Использование ретровирусных векторов для трансгеиеза
сельскохозяйственной птицы.
1.7.1 Структура генома и жизненный цикл ретровирусов
1.7.2 Перенос чужеродных генов с помощью ретровирусных
векторов.
1.7.3 Получение трансгенной сельскохозяйственной птицы с
использованием ретровирусных векторов
1.8 Генетическая трансформация клеток яйцевода
сельскохозяйственной птицы.
2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Реактивы и оборудование.
2.2 Животные
2.3 Гистологические исследования
2.3.1 Приготовление гистологических препаратов белкового отдела
яйцевода.
2.3.2 Определение содержания ДНК в клетках белкового отдела
яйцевода кур.
2.3.3 Изучение пролеферактивной активности клеток яйцевода кур
под действием эстрогена.
2.4 Работа с культурой клеток
2.5 Трансформация клеток яйцевода кур
2.5.1 Генные конструкции.
2.5.2 Трансфекция клеток кур i vi
2.5.3 Введение генных конструкций в клетки яйцевода кур i viv.
2.6 Анализ па наличие генной конструкции.
2.7 Анализ экспрессии рекомбинантных белков
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Особенности гистогенеза яйцевода кур в различные
возрастные периоды
3.2 Динамика изменения содержания ДНК в клетках
эпителиального слоя белковой части яйцевода кур.
3.3 Трансфекция клеток кур ретровирусными векторами i vi.
3.4 Трансформация клеток яйцевода кур i viv
3.4.1 Введение в яйцевод кур генной конструкции
3.4.2 Оптимизация условий введения рекомбинантной ДНК в
клетки яйцевода кур i viv.
3.4.3 Введение в яйцевод кур генной конструкции
i,содержащий кДНК инсулина человека
3.4.4 Введение в яйцевод кур генной конструкции XV
содержащей кДНК гормона роста человека
3.4.5 Разработка путей повышения эффективности трансгенеза
яйцевода кур i viv
3.5 Анализ факторов, влияющих на эффективность генетической
трансформации клеток яйцевода кур.
4 ВЫВОДЫ.
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..
6 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
Актуальность


Научная новизна. Впервые изучена пролиферативная активность и особенности гистогенеза клеток эпителиального слоя белкового отдела яйцевода кур в различные возрастные периоды в динамике. Исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в клетки белкового отдела яйцевода кур посредством использования ретровирусных векторов. Изучены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации клеток яйцевода i viv. Рассмотрено влияние полового гормона на пролиферативную активность клеток неполовозрелого яйцевода. Практическая значимость. Отработан метод введения генных конструкций в эпителиальный слой белкового отдела яйцевода кур i viv, позволяющий трансформировать клетки эпителиального слоя до ,3. Установлен возраст кур, оптимальный для введения генных конструкций в клетки яйцевода i viv. Предложена схема гормональной обработки кур в раннем возрасте, позволяющая повысить пролиферативную активность клеток неполовозрелого яйцевода. Доказано наличие рекомбинантной ДНК в секреторных клетках эпителия яйцевода подопытных кур по достижении ими половозрел ости. Клетки эпителия белкового отдела яйцевода могут быть трансформированы с использованием ретровирусных векторов. Оптимальным возрастом для эффективного введения генных конструкций в клетки яйцевода кур i viv является период от 4 до 4,5 месяцев. Гормональная обработка кур в раннем возрасте 0,1 синэстролом позволяет повысить эффективность генетической трансформации клеток яйцевода i viv. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных БиоТехЖ, Дубровицы, г. Генетика и селекция в животноводстве вчера, сегодня, завтра, С. Петербург, г. Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, , гг. Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, в т. ВАК РФ 2. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 1 странице, состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 7 таблиц и рисунка. Библиографический список включает 1 источник, в том числе 1 на иностранных языках. Яичник является местом образования желтка яйцевых клеток, обогащенных питательным веществом. В начальной стадии эмбрионального развития образуются левый и правый яичники, но в дальнейшем правый яичник и правый яйцевод постепенно отстают в росте на пятый седьмой день инкубации левый яичник уже больше правого. У взрослых птиц в полной мере развиваются и функционируют только левый яичник и левый яйцевод, а правый яичник и правый яйцевод остаются в недоразвитом рудиментарном состоянии i . ., . Яичник расположен в поясничной части брюшной полости, перед левой почкой. У взрослой несущейся курицы яичник гроздевидный. Такой вид ему придают шаровидные желтки различной величины, покрытые тонкой оболочкой, богатой сосудами. Каждая яйцеклетка с желтком, заключенная в оболочку фолликул, подвешена к строме. Яичник продуцирует гормоны эстроген, андроген и прогестерон. Яйцевод орган, по которому проходит яйцо. За период продвижения желтка по яйцеводу к нему добавляются две трети содержимого яйца белок, подскорлуповые пленки, известковая скорлупа. У ненссушейся курицы длина яйцевода колеблется в пределах см, диаметр 0,30,8мм. В период максимальной яйцекладки длина его может увеличиваться до см, а диаметр до см . .,. Г1о морфологическим признакам и физиологическим функциям яйцевод делится на пять отделов, или участков воронку, белковый отдел, перешеек, матку, влагалище Федотов С. В.,. Воронка передняя часть яйцевода, имеет овальное отверстие диаметром 89см, открывается в брюшную полость около яичника. Стенки воронки у устья утончены и несколько выпячены, образуя как бы ее губы, которые мышечными связками соединяются с брюшной стенкой.