Генетическое разнообразие Francisella tularensis из природных очагов России

• Автор: Тимофеев, Виталий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 170 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие сведения о туляремийном микробе

1.2 Таксономия и вирулентность рода Franciselia

1.3 Лабораторная диагностика F. tularensis

1.4 Внутривидовая дифференциация F. tularensis

1.4.1 Генотипирование F. tularensis

1.4.2 Генетические основы основных биохимических различий подвидов F. tularensis

1.5 Заключение по обзору литературы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 2 ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
2.1 Генотипическая гетерогенность и географическое разнообразие штаммов F. tularensis из коллекции ГНЦ ПМБ по данным VNTR-типирования их ДНК по A. Johansson
2.2 Обнаружение F. tularensis subsp. mediasiatica на территории 70 Российской Федерации
2.3 Определение минимального числа VNTR-локусов, позволяющего сохранить разрешающую способность MLVA
2.4 Обсуждение и выводы
ГЛАВА 3 ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ БИОХИМИЧЕСКИХ
РАЗЛИЧИЙ ПОДВИДОВ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
3.1 Изучение генетических детерминант ß-лактамазной активности
F. tularensis
3.1.1 Анализ распространененности генов ß-лактамаз и их последовательностей у штаммов разных подвидов F. tularensis
3.1.2 Изучение расположения генов ß-лактамаз в геноме штаммов разных подвидов F. tularensis
3.1.3 Изучение экспрессии генов ß-лактамаз в культурах
F. tularensis штаммов 15 НИИЭГ и 120 Дриг
3.1.4 Получение и оценка биологических свойств вариантов штамма F. tularensis 15 НИИЭГ с инактивированными генами ß-лактамаз
3.1.5 Получение АЫа! и ДЫаЗ мутантов F. tularensis 15 НИИЭГ с помощью плазмиды pGM
3.1.6 Получение плазмиды pGM
3.1.7 Получение ДЫа2 мутантов F. tularensis 15 НИИЭГ с помощью плазмиды pGM
3.1.8 Оценка ростовых, патогенных и протективных свойств мутантных шаммов 15ДЫа2 и 15ДЫа
3.1.9 Изучение экспрессии мРНК в штаммах с инактивированными генами ß-лактамаз

3.1.10 Изучение чувствительности Р. Ш1агепх1$ к антибиотикам класса (З-лактамов
3.1.11 Сравнение чувствительности к Р-лактамам штаммов
Б. иОагег^Б в зависимости от подвидовой принадлежности
3.1.12 Определение чувствительности к антибиотикам штаммов
Р. ш1агеп$18 с инактивированными генами Р-лактамаз
3.1.13 Комплементация чувствительности к ампициллину плазмидами, несущими маркер ампициллин-резистентности
3.1.14 Изучение сравнительной р-лактамазной активности
Р. Магети эибэр ще<7дш'аП'са и Ио1агсИса
3.2 Изучение генетических основ цитруллинуреидазной активности Д. /м/агетшЗ
3.2.1 Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей гена цитруллинуреидазы у представителей рода Дгаи.нсе//а и гетерологичных микроорганизмов с помощью алгоритма ПРО МЛ
3.2.2 Сравнение нуклеотидных последовательностей генов цитруллинуреидазы штаммов туляремийного микроба разных подвидов
3.2.3 Сравнение аминокислотных последовательностей генов цитруллинуреидазы штаммов туляремийного микроба разных подвидов
3.3 Выявление генетических особенностей, потенциально ответственных за устойчивость Р. 1и1агет1ь БиЬзр. ко1агсйса Ьу. II к эритромицину
3.4 Выявление генетических основ различной способности подвидов Р. 1и1агет1в к сбраживанию сахарозы
3.5 Применение ПЦР для идентификации Р. т1агет1з и ее подвидовой дифференциации в смеси культур и клиническом материале
3.6 Изучение возможности одновременного применения праймеров комплементарных гену iglC с праймерами сЫП в тест-системе
для подвидовой идентификации Р. Ш1агет!$
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,
ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
ПРИЛОЖЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Туляремия - зоонозная природно-очаговая особо опасная инфекция, возбудитель которой - РгапЫэеИа 1и1агет1х - инфицирует более 250 видов животных и передается человеку множеством способов - прямым контактом с зараженным животным, приёмом внутрь контами-нированной воды и пищи, аэрогенным путем, а также через укусы клещей, мух и комаров. Возбудитель туляремии принадлежит к семейству РгапаьеПасеае, роду Ргапсл$е11а [175]. Согласно принятой в настоящее время зарубежной классификации, в пределах вида Р. 1и1агет$ выделяют четыре подвида туляремийного микроба: Пйаггт1$ (то же, что и пеагсПса) - тип А, Ио1агсИса (то же, что и ра1аеагсНса) — тип В, тесИаь^аМса и почс1с1а. Подвид Ио1агсНса включает в себя три биологических варианта: ]аротса - японский биовар, биовар I Егу(8) (эритромицинчувстви-тельный) и биовар II Егу(Я) (эритромицинрезистентный).
Степень патогенности различна у разных подвидов /7 /и/агеи^й [56]. Наибольшей вирулентностью для человека обладает У7. Ш1агет1$ подвида Гм/агегш'з- (пеагсйса) - уровень смертности зараженных штаммами этого подвида людей без лечения достигает 60 % [69]. Генетические основы для высокой степени вирулентности до сих пор неизвестны. К Ш1агетгз зиЬэр. Шагеп-.ук распространен в Северной Америке, однако публиковались данные о выделении штаммов этого подвида на территории Европы [92, 104]. Европейские изоляты Р. Ги1агепз13 в основном относятся к подвиду ко1агсйса, и, хотя инфекция, вызванная штаммами Р. ш1агеп.ч1з яиЬэр. Ио-1агсИса очень контагиозна и вызывает тяжелую патологию, болезнь редко заканчивается смертельным для человека исходом [56]. На территории России встречается Р. ш1агет15 подвида Ио1агсИса представленного двумя биоварами - I Егу(8) и II Егу(Я), циркуляция которых осуществляется главным образом среди грызунов и зайцеобразных. По поводу вирулентности встречающегося в средней азии среднеазиатского подвида Т7. 1и1агепш - зиЬяр. тесИа$Ш1са - опубликованы немногочисленные данные, свидетельствующие о способности этих бактерий вызывать инфекцию у человека и кроликов [144]. Возбудитель Т7. ш/агеи.?« подвида novicida считается невирулентным для человека, единичные случаи выделения туляремийного микроба этого подвида от людей касались только лиц со сниженным иммунным статусом [117].
С учетом вышеизложенного, подвидовая идентификация культур Т7. Ш/агегаА, выделенных из клинических изолятов или объектов среды, является важнейшим этапом диагностики, так как обеспечивает предварительную оценку степени вирулентности и эпидемиологической опасности выделенной культуры.

Генетические основы высокой степени вирулентности этого подвида до сих пор неизвестны. Хотя К 1и1агет[и эиЬзр. как полагают, происходит из Северной Америки,
были опубликованы данные о выделении штаммов этого подвида на территории Европы [92, 104]. В основном же все европейские изоляты Р. ш1агепх'1.ч относятся к подвиду Ио1агсИса, и, хотя инфекция, вызванная штаммами К ш1агет1<ч этого подвида, очень контагиозна и вызывает тяжелую патологию, болезнь редко заканчивается смертельным для человека исходом [56]. На территории России встречается К Ыагетчэ подвида Ио!агсИса с двумя биоварами - I Егу(8) и II Егу(Я), циркуляция которых осуществляется, главным образом, среди грызунов и зайцеобразных.
По поводу вирулентности да Р. Ш1агет15 эиЬзр. тесНаягаМса опубликованы лишь немногочисленные данные, свидетельствующие о способности этих бактерий вызывать инфекцию у человека и кроликов [144].
Возбудитель Р. 1и1агет'18 подвида пошс1йа считается невирулентным для человека; единичные случаи выделения туляремийного микроба этого подвида от людей касались только лиц со сниженным иммунным статусом [117]. Следует отметить, что определение различий в вирулентности штаммов Р. ш1агет1$ методом биопробы затруднено, так как наиболее широко применяемая биомодель экспериментальной туляремии - мыши - высоко чувствительны к заражению всеми подвидами Р. ш1агет18, кроме подвида поггсп/а.
С учетом вышеизложенного, подвидовая идентификация культур Г. ш/агстА, выделенных из клинических изолятов или объектов среды, является важнейшим этапом диагностики, так как обеспечивает предварительную оценку степени вирулентности и эпидемиологической опасности выделенной культуры. Внутривидовая дифференциация возбудителя туляремии традиционно основывается на географической локализации места выделения культуры, ее патогенности для человека и животных, а также на ряде биохимических признаков: способности к сбраживанию сахарозы и глицерина, цитруллинуреидазной и (3-лактамазной активности (таблица 9), а также чувствительности к эритромицину. В настоящее время для видовой и подвидовой идентификации К ш/агт?м также применяются методы молекулярного типирования: определение межгенных повторяющихся (ЕШС-РСЯ) и внегенных палиндромных последовательностей (ИЕР-РСЯ), применение универсальных (случайных) праймеров в системе РАРО-РСЯ [151], анализ полиморфизма единичных нуклеотидов - 814Р-типирование [147], МГУ А- типи-рование [105]. Однако их практическое использование часто ограничено сложностями методики, проблемами с воспроизводимостью и оценкой результатов.