Структурно-функциональный анализ ингибитора ДНК-гиразы микроцина Б

• Автор: Гиляров, Дмитрий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.01.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил.

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

Публикации и апробация работы

Структура и объем работы

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ДИТЕРАТУРЫ

I. ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫ и их функции в клетке

ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫ ТИПА 1А
Обратная гираза
ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫ ТИПА 1В
ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗЫ II ТИПА
Инициация репликации
Репликация ДНК
Транскрипция
Рекомбинация ДНК
ТОПОИЗОМЕРАЗЫ И ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМАТИНА
II. Ингибиторы ДНК-топоизомераз
КАМПТОТЕЦИН И ДРУГИЕ ИНГИБИТОРЫ ТОПОИЗОМЕРАЗЫ I
Хинолоны
Кумарины
Циклотиалидины
Аминобензимидазолы
Симоциклиноны
КЛЕРОЦИДИН
ДИСТАМИЦИН А И ДРУГИЕ ВЕЩЕСТВА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С МАЛОЙ БОРОЗДКОЙ ДНК
ССОВ
ЙУЯ|
МИКРОЦИН Б
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оборудование
РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

РЕАКТИВЫ И ФЕРМЕНТЫ
буферные растворы
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ
Бактериальные штаммы
ПОЛУЧЕНИЕ РЕЛАКСИРОВАННОЙ ДНК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ДНК-ГИРАЗЫ IN VITRO
ОПЫТ ПО РАСЩЕПЛЕНИЮ ДНК ДНК-ГИРАЗОЙ IN VITRO
ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРОЦИНА ИЗ КЛЕТОК £ COU И ВЭЖХ-АНАЛИЗ
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (МАЛДИ И ТАНДЕМНАЯ МС)
Химические модификации микроцина Б
Определение антибактериальной активности антибиотиков и демонстрация SOS-otbeta
САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ МУТАГЕНЕЗ
Электрофорез ДНК в агарозном геле
ЛИГИРОВАНИЕ ПРОДУКТА АМПЛИФИКАЦИИ В ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРА
Рестрикция
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКИ КОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК £ сои
Трансформация замороженных компетентных клеток £ сои
Анализ колоний Е.сои
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК (МИНИПРЕП)
Секвенирование
ПЕРЕОСАЖДЕНИЕ ДНК СПИРТОМ
Экстракция ДНК фенолом
Ингибирование репликации в пермеабилизованных клетках Е. сои
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
Характеризация выделяемого из клеток микроцина Б
Химические модификации микроцина Б
Щелочной гидролиз модифицированного по Ser52 микроцина подтверждает наличие сложноэфирной связи в микроцине «X»
Биологическая активность вещества X и переход Х-ЭЫ
Направленный мутагенез микроцина Б
Структурно-функциональный анализ микроцина Б
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ПРОЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список СОКРАЩЕНИЙ
АТР (АТФ)-аденозинтрифосфорная кислота cpm - counts per second СТР (ЦТФ)-цитидинтрифосфорная кислота CFX - ципрофлоксацин
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография GTP (ГТФ)-гуанозинтрифосфорная кислота Да - Дальтон
DMSO (ДМСО) - диметилсульфоксид ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота DTT - дитиотреитол
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота IPTG (ИПТГ) - изопропилтиогалактозид
МАШ1(МАДЦИ) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация мРНК - информационная (матричная) РНК МсВ-микроцин Б
dNTP - смесь дезоксирибонуклеотидов (dGTP, dATP, dTTP и dCTP)
NHS - W-гидроксисукцинимид
o.e. - оптические единицы
PCR (ПЦР) - полимеразная цепная реакция

[107]. Накопление таких тупиковых комплексов приводит к фрагментации хромосом и гибели клетки.
Как уже упоминалось, хинолоны активны по отношению к ДНК-гиразе и по отношению к ДНК-топоизомеразе IV. Преимущественная активность хинолонов в отношении того или другого фермента определяется видом микроорганизма и структурой ингибитора. В Грам-отрицательных бактериях хинолоны действуют преимущественно на ДНК-гиразу, а в Грам-положительных- на ДНК-топоизомеразу IV.
Устойчивость к хинолонам возникает при мутациях в хромосомных генах, кодирующих ДНК-топоизомеразу IV и ДНК-гиразу. Такие мутации обычно попадают в район с 67 по 106 аминокислоту субъединицы GyrA-это так называемый район устойчивости к хинолонам. Мутации в этом районе значительно уменьшают аффинность хинолонов к переходному комплексу. Другие механизмы резистентности к хинолонам связаны с белками, участвующими в транспорте лекарств в клетку, или их инактивацией на пути к белку-мишени. Известен и принципиально иной механизм резистентности к хинолонам - этот механизм связан с существованием белков «иммунности». Ген qnr был обнаружен на плазмиде в устойчивом к хинолонам штамме Klebsiella pneumoniae [108]. Секвенирование этого гена позволило отнести его продукт к гетерогенному семейству белков с пентапептидными повторами. В семействе белков, содержащих пентапептидные повторы, более пятисот белков, функции многих их которых неизвестны. Тем не менее обнаружили, что ещё два из них: McbG из E. coli и MfpA из Mycobacterium tuberculosis тоже способны обеспечивать устойчивость ДНК-гиразы к ингибиторам [109], [110]. Однако, механизм действия этих белков ещё плохо изучен.