Разработка ПЦР тест-системы для идентификации ДНК пушных зверей

• Автор: Панина, Екатерина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.06, 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Щелково
• Количество страниц: 113 с.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы С

Цель и задачи исследования

Научная новизна работы.

Практическое значение работы.

Апробация диссертации

Объем и структура диссертации

ЧАСТЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Проблема определения видовой принадлежности мясных ингридиентов.

1.1 .Прионные болезни.
1.2. Алеутская болезнь норок.
2. Методы определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах.
3. Принцип полимеразной цепной реакции.
4. Подбор праймеров
4.1. Дизайн праймеров
4.2. Температура отжига
5. Факторы, влияющие на ПЦР
5.1. Температура и время денатурации.
5.2. Температура и время элонгации.
5.3. Реакционный буфер.
5.4. Количество циклов амплификации
5.5. Горячий старт ПЦР.
5.6. Контаминация в ПЦР и предложения по обустройству ПЦРлаборатории
5.7. Ингибирование ПЦР.
5.8. Внутренний контрольный образец ВКО
ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и КОМПЬЮТЕРНЫЕ ПРОРАММЫ для обработки этих данных.
2. Образцы сравнения ДНК.
2.1. Коммерческие препараты ДНК
2.2. Самостоятельно полученные образцы ДНК.
3. Образцы мясного фарша, куриной, рыбной и мясокостной муки
4. Образец сыворотки лошадей.
5. Методика выделения ДНК из цельной крови по ii.
5.1. Выборочный лизис эритроцитов.
5.2. Обработка лейкоцитарного осадка протеиназой К
5.3. Экстракция ДНК фенолхлороформом с последующей преципитацией этанолом
6. Оценка концентрации ДНК спектрофотометрическим методом
7. Методика выделения ДНК сорбцией на селикагеле по
8. Методика проведения реакции амплификации
8.1. Состав реакционной смеси, условия амплификации.
8.2. Горячий старт
9. Методика проведения электрофореза в агарозном геле
. Методика обработки посуды хромовой смесыо.
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Выбор олигоиуклеотидных праймеров для амплификации ДНК пушных зверей
2. Изучение специфичности выбранных праймеров
3. Подбор условий ПЦР
3.1. Оптимизация температуры отжига праймеров.
3.2. Подбор концентрации праймеров
3.3. Применение горячего старта.
4. IРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ВЫБРАННОЙ СИСТЕМЫ АМПЛИФИКАЦИИ.
5. Подбор методов выделения очистки ДНК из муки
6. Внутренний контрольный образец ВКО
7. Отрицательные и положительные контрольные образцы.
8. Состав разработанной тестсистемы.
9. Определение чувствительности и специфичности разработанной тестсистемы.
. Комиссионные испытания ПЦРтестсистемы ПЗ
. Изучение активности и стабильности ПЦРтестсистемы в зависимости огсрока хранения.
. Тестирование кормов на содержание днк пушных зверей методом ПЦР
ОБСУЖДЕНИЕ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
ЛИТЕРАТУРА


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. Научная новизна работы. Практическое значение работы. ЧАСТЫ. Проблема определения видовой принадлежности мясных ингридиентов. Прионные болезни. Алеутская болезнь норок. Методы определения видовой принадлежности мясных ингредиентов в кормах. Принцип полимеразной цепной реакции. Температура и время денатурации. Температура и время элонгации. Реакционный буфер. Горячий старт ПЦР. Ингибирование ПЦР. ЧАСТЬ 2. ГЛАВА 1. Базы данных нуклеотидных последовательностей ДНК и КОМПЬЮТЕРНЫЕ ПРОРАММЫ для обработки этих данных. Образцы сравнения ДНК. Самостоятельно полученные образцы ДНК. Образец сыворотки лошадей. Методика выделения ДНК из цельной крови по ii. Выборочный лизис эритроцитов. Состав реакционной смеси, условия амплификации. Методика обработки посуды хромовой смесыо. ГЛАВА 2. Оптимизация температуры отжига праймеров. Применение горячего старта. IРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ВЫБРАННОЙ СИСТЕМЫ АМПЛИФИКАЦИИ. Отрицательные и положительные контрольные образцы. Состав разработанной тестсистемы. Определение чувствительности и специфичности разработанной тестсистемы. КОМ. Изучение активности и стабильности ПЦРтестсистемы в зависимости огсрока хранения. ЛИТЕРАТУРА. ПРИЛОЖЕНИЯ. В последние годы были отмечены случаи поставок в Российскую Федерацию кормов, предназначенных для пушного звероводства, фальсифицированных, а также контаминированных тканями плотоядных животных. Использование такой продукции приносит большой экономический ущерб пушному звероводству изза опасности распространения трансмиссивной энцефалопатии и алеутской болезни норок. Алеутская болезнь норок АБН или вирусный плазмоцитоз высоко контагиозная болезнь норок и хорьков, возникающая вследствие персистентной вирусной инфекции. Она характеризуется медленным развитием инфекционного процесса и пожизненной виремией. В организме больных норок вирус находится в сыворотке крови, головном мозге, мезентериальных лимфатических узлах, почках, селезенке, печени, слюнных железах, кишечнике. Высокая восприимчивость животных к АБН, устойчивость возбудителя к внешним условиям, использование в качестве корма тушек забитых зверей и мясокостной муки из таких тушек Самуйленко А. Я., . Болезнь наносит огромный экономический ущерб зверосовхозам в связи с высокой смертностью , ухудшением качества пушнины, снижением плодовитости самок и необходимостью проведения ограничительных и ветеринарносанитарных мероприятий.