Изучение химерных растений Brassica napus L. при генетической трансформации

• Автор: Хоанг Тхи Жанг
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.01.05
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Регенерация растений рода i

1.1.1. Зависимость морфогенеза от источника экспланта.

1.1.2. Зависимость морфогенеза от генотипа растениядонора

1.1.3. Зависимость морфогенеза от состава среды.

1.2. Методы получения трансформированных растений.

1.2.1. Перенос ДНК с помощью агробактерий

1.3. Селекция трансформированных тканей растений
1.4. Экспрессия чужеродных генов в трансформированных растениях.
1.5. Трансформация растений рода i с номощыо i i.
1.6. Получение трансгенных растений рода i.
1.6.1. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам
1.6.2. Трансгенные растения, устойчивые к патогенам.
1.6.3. Трансгенные растения с измененным составом жирных кислот.
1.6.4. Трансгенные растения с измененным составом белка.
1.6.5. Трансгенные растения с мужской стерильностью.
1.6.6. Трансгенные растения, устойчивые к стрессовым воздействием.
1.7. Наследование встроенных генов в растенияхтрансформантах.
1.8. Химерность.
ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
II. 1. Характеритика объекта исследования.
.2. Среды для культивирования растений и растительных тканей
.З. Получение эксплантов
.4. Регенерация растений
.5. Укоренение растенийрегенерантов и высадка в почву
.6. Бактериальные штаммы и среды для выращивания бактерий.
.7. Трансформация растений
И.8. Анализ трансформированных растений.
И.8.1. Тестирование на устойчивость растений к Км.
.8.2. Микроскопический анализ экспрессии гена р в растительном материале
.8.3. Методы молекулярной биологии
II.9. Биохимический анализ семян трансгенных растений.
.9.1. Определение содержания белка
.9.2. Определение содержания жирных кислот
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1. Влияние различных факторов питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов изучаемых сортов рапса
1.2. Трансформация двух типов эксплантов рапса
.2Л. Освобождение эксплантов от бактериальной инфекции.
1.2.2. Влияние сорта и регуляторов роста на частот регенерации при
аробактериальной трансформации.
Ш.З. Анализ растенийтрансформантов.
.3.1. Влияние типа эксплантов на частоту трансформации.
Ш.З.2. Влияние антибиотика канамицииа на частоту трансформации
1.3.3. Влияние концентрации сахарозы на частоту трансформации листовых
эксплантов
III. 4. Микроскопический анализ экспрессии гена 5
Ш.4.1. Экспрессия гена в каллусиой ткани и образовавшихся из нее побегах
Ш.4.2. Экспрессия гена р в полученных трансформированных растениях
Ш.4.3. Экспрессия гена р в генеративных органах трансформированных
растений
Ш.4.4. Локализация белка СЕР в клетках трансгенных растений
II 1.5. Изучение наследования встроенного гена р.
1.6. Биохимический анализ семян трансгенных растений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поэтому, для создания генетически однородных растенийтрансформантов очень важно знать причины подобного явления, одной из которых может быть образование химер, то есть организмов, состоящих из генетически неоднородных клеток и чтобы исключить их формирование. Химерность растенийтрансформантов описывалась у некоторых видов, например, табака i, , i . i, , картофеля i . i, , , льна , , , капусты i . . . . Полученные в некоторых случаях химеры составляли до растенийрсгснерантов. Авторы поразному объясняют причины возникновения химерных растений результатом происхождения растений не из одной клетки, а из группы клеток первичного экспланта i, . . i . i . Однако этот вопрос совершенно не исследован, и авторы, показавшие образование химерных трансгенных растений, не обсуждают причины этого феномена. Выяснение механизмов образования химерных растений позволило бы исключить условия их возникновения. Цель и задачи исследований. Цель данной работы изучить химерные растения i парт, полученные при проведении генетической трансформации и выяснить причины их образования. Изучить влияние различных факторов питательной среды на морфогенетическую активность изолированных эксплантов при трансформации изучаемых сортов рапса. Изучить образование химерных растений рапса после генетической трансформации. Исследовать экспрессию встроенного гена на этапах каллусообразования и морфогенеза. Провести анализ растенийтрансформантов рапса на наличие встроенного гена . Проверить потомство трансгенных растений на наследование встроенного гена . Научная новизна работы. Оптимизированы условия регенерации и трансформации разных сортов рапса с использованием семядольных и листовых эксплантов. Результаты по протоколу регенерации ярового рапса сорта Подмосковный являются оригинальными и проведены впервые. V и Подмосковный. Впервые проведена трансформация растений рапса без применения селективного фактора и определено его влияние на эффективность трансформации. Впервые установлено влияние содержания сахарозы в среде для морфогенеза на дифференциацию побегов, полученных на листовых эксплантах рапса, а также на эффективность трансформации. Выявлены существенные различия в свечении белка ОРР в зависимости от первичного экспланга и стадии развития растенийрегенерантов. Анализ растений Т показал, что у трансгенных растений наследование гена зависит от типа исследуемого экспланта. Установлены факторы, оказывающие влияние на проявление неменделевского наследования встроенного гена у трансгенных растений рапса, которые, вероятно, связаны с образованием генотипических химер. Показано, что основным фактором проявления этого является тип первичного экспланта. Выявлено, что расхимеривание не зависит от расположения стручков на цветоносе, но зависит от числа черенкований растенийтрансформантов. ГЛАВА I. Одной из важнейших особенностей биотехнологических методов является возможность получения целого растения из отдельной генетически измененной клетки при морфогенетическом ответе растения. Получение растенийрегенерангов важная составная часть метода генетической трансформации. Ткани большинства генотипов растений обладают способностью к морфогенетическому ответу, под которым понимают связанную с тотипотентностью имеющейся 1з каждой клетке генетической информацией целого растения возможность регенерировать из отдельных клеток органы, эмбриоиды или целые растения Бутенко, , , Пирузян, . Любой эксплант в неблагоприятных условиях может, повидимому, иметь физиологический блок регенерации. Для того, чтобы его преодолеть и получить морфологический ответ, на эксплант можно воздействовать, варьируя различными факторами. Т. А. и К. Физиологического состояния тканидонора. Последние зависят от ряда биохимических, физиологических и молекулярных событий, вызванных активностью соответствующих генов в популяции клеток, что и приводит в конечном случае к инициации морфогенеза , , .