Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки

• Автор: Вячеславова, Алиса Олеговна
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

Г лава 1. Обзор литературы

1.1 Подходы к экспрессии гетерологичных генов в растениях

1.1.1. Стабильная экспрессия

1.1.2. Транзиентная экспрессия

1.2. Обзор генетических детерминант, обуславливающих

высокую экспрессию трансгена на разных уровнях: транскрипция, трансляция, стабильность белка

1.2.1. Регуляторные элементы, позитивно влияющие на уровень 22 транскрипции

1.2.2. Процессинг и сплайсинг пре-мРНК

1.2.3. Регуляторные элементы, позитивно влияющие на уровень
трансляции
1.2.4. Регуляторные элементы, позитивно влияющие на 30 стабильность белка
1.3. Векторы для экспрессии гетерологичных генов в растениях
Глава 2. Материалы и методы
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Поиск генетических детерминант, позитивно влияющих на 62 уровень транскрипции, трансляции и стабильности целевых
белков в растениях
3.1.1 Поиск генетических детерминант, позитивно влияющих на 62 уровень транскрипции в растениях
3.1.2 Поиск генетических детерминант, позитивно влияющих на 72 уровень трансляции в растениях
3.1.3. Поиск генетических детерминант, позитивно влияющих на 75 уровень стабильности белков в растениях
3.2. Создание модульных векторов для апробации регуляторных
элементов с использованием бирепортерных генов
3.2.1. Конструирование бифункциональных репортерных генов

//сВМЗ-г/у) и egfp-licQЫЪ
3.2.2 Апробация функционировании сконструированных бирепортерных генов в бактериальных клетках
3.2.3 Описание и конструирование модульных векторов серии рРОО и рУЮ-Б
3.2.4. Клонирование бирепортерных генов и регуляторных последовательностей в базовый модульный вектор серии рРОв
3.2.5. Клонирование бирепортерных генов и регуляторных последовательностей в базовый модульный вектор серии рУЮ
3.3. Апробации модульных векторов с репортерными генами и различными регуляторными элементами
3.4. Анализ последовательностей модельных и целевых генов и модификация их кодонового состава
3.4.1 Анализ нуклеотидной последовательности гена, кодирующего рекомбинантный белок-носитель
термостабильную лихеназу (ЫсВМЗ-СР)
3.4.2 Анализ и модификация нуклеотидной последовательности гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (вРР)
3.4.3 Анализ и модификация нуклеотидной последовательности гена, кодирующей интерферон-альфа-2А
3.4.4 Модификация кодонового состава нуклеотидных последовательностей, кодирующих модельные и целевые белки
3.5. Создание модульных векторов, несущих модельные и целевые гены с модификациями кодонового состава и без модификации
3.5.1. Конструирование вектора, несущего транскрипционнотрансляционное слияние гена, кодирующего интерферон-альфа-2А с оптимизированным и неоптимизированным кодоновым составом, и гена, кодирующего термостабильную лихеназу.
3.5.2. Клонирование последовательностей, кодирующих гибридные гены тнео-НсВМЗ и нй'опт-ИсВМЗ, и гены, кодирующих рекомбинантную термостабильную лихеназу с

оптимизированным и неоптимизированным кодоновым составом, в вектора серии рРвЄ и рУЮ-8.
3.6. Сравнительный анализ экспрессии модельных и
целевых генов с оптимизированным и неоптимизированным кодоновым составом в растениях табака разных видов Выводы
Список литературы

относятся метионин (Met), глицин (Gly), валин (Val), треонин (Thr), серии (Ser) и аналин (Ala) [Worley et al., 1998].
Asn N-Gln Q.
NTA1
-GItr EO
ATE1

no, oa Cys
Tertiary
cys c-m Asn N_
Gin q-B

0 iGIUe
NTAQ1
ATE1

N-recognin

Secondary
с -, R-transferase

Primary
R-C* '

Yeast
UBR1/2/4/5 N-recognins
» Proteasome
Mammals
Рисунок 8. Схематическое представление правила N-конца в дрожжах и млекопитающих. Овалы обозначают основание белка. Остатки N-конца обозначены однобуквенными сокращениями. С* обозначает окисленный N-конец Cys. Asn, Asp, Gin, Glu, Cys - остатки аспирагина, аспарагиновой кислоты, глутамина, глутаминовой кислоты и цистеина, соответственно [Wang et al., 2009].
У грибов и животных N-концевые третичные дестабилизирующие аминокислоты Asn и Gin для превращения во вторичные (Asp и Glu) проходят стадию ферментативного деамидирования. В дрожжах Saccharomyces cerevisiae, N-концевая амидогидролаза (Nt-амидаза) NTA1 может осуществлять ферментативное превращение N-концевых Asn и Gin [Baker и Varshavsky, 1995] (рисунок 8а). Напротив, у животных есть две разные Nt-амидазы, Asn-специфическая амидаза (NtN-амидаза или NTAN1) [Grigoryev et al., 1996; Kwon et al., 2000] и недавно обнаруженная Gln-специфическая Nt-амидаза, которую называют NtQ-амидазой или NTAQ1 [Wang et al., 2009] (рисунок 8Ь). Для активации вторичных дестабилизирующих а.о. Asp и Glu необходима их конъюгация с аргинином (одним из первичных дестабилизирующих а.о.) с участием фермента Arg-тРНК-трансферазы (R-трансферазы) [Varshavsky, 1996; Kwon et al., 2002; Hu et al., 2006]. У млекопитающих, взаимодействию с аргинином подвергается и N-концевой остаток Cys после неферментативного окисления с участием окиси азота (N0) и кислорода [Hu et al., 2005; Lee et al., 2005] (Рисунок 8b).