Разработка и совершенствование методов трансфекции экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур

• Автор: Самойлов, Артем Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: п. Родники, Московская обл.
• Количество страниц: 102 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Продуценты белков фармацевтического назначения

1.2. Генные конструкции

1.3. Трансгенная птица

1.3.1. Получение трансгенных кур с помощью первичных эмбринальных клеток

1.3.2. Получение трансгенных кур с помощью долгосрочных линий эмбриональных клеток

1.3.3. Трансфекция с помощью сперматозоидов как переносчиков чужеродной ДНК

1.4. Методы определениея интеграции и экспрессии

чужеродной ДНК
2. Материалы и методы
2.1. Биологический материал
2.1.1. Содержание экспериментальной птицы
2.1.2. Получение спермы и проведение искусственного осеменения
2.1.3. Плазмиды, использованные в работе
2.2. Проведение трансфекции сперматозоидов
2.3. Определение интеграции чужеродной ДНК
2.3.1. Выделение ДНК из тканей эмбрионов
2.3.2. Выделение ДНК из цельной крови
2.3.3. Определение интеграции методом ПЦР
2.4. Методы определения экспрессии встроенного гена
2.5. Культивирование зародышевых клеток
2.5.1. Приготовление БТО клеток
2.5.2. Приготовление эмбрионального экстракта
2.5.3. Выделение и культивирование гонадных примордиальных и бластодермальных зародышевых клеток
2.6. Гистохимическое и иммуногистохимическое окрашивание эм-

бриональных клеток
2.7. Трансфекция первичных примордиальныхклеток и инъекция их в зародышевый серп
2.7.1. Стерилизация реципиентов
2.7.2. Проведение трансфекции первичных гонадных клеток с помощью липофекции
2.7.3. Инъекция трансфецированных гонадных клеток
3. Результаты исследований
3.1. Разработка и совершенствование методов получения трансгеной птицы с использованием первичных половыхи стволовых клеток кур.
3.1.1. Получение трансгенных эмбрионов кур с использованием первичной культуры примордиальных клеток
3.1.2. Разработка метода получения линии первичных половых
клеток
3.1.3 Разработка метода получения бластодермальных клеток кур
3.1.3.1 Культивирование бластодермальных клеток с использованием мышиного ЬШ
3.1.3.2 Разработка метода культивирования бластодермальных клеток с эмбриональным экстрактом
3.2. Разработка и совершенствование методов получения трансгенной птицы с использованием сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК
3.2.1. Влияние манипуляционных воздействий и индивидуальных особенностей птицы на эффективность оплодотворения
3.2.2 Изучение оптимальных режимов подготовки образцов тканей и условий для проведения ПЦР - анализа
3.2.3 Получение трансгенной птицы с геном ГКСФ человека методом опосредованного переноса с помощью сперматозоидов
3.2.4 Экспрессия чГТССФ в крови трансгенной птицы
3.2.5 Наследование чужеродного гена в поколении Б]
4. Обсуждение результатов исследования
5. Выводы

6. Сведения о практическом использовании результатов
исследования
7. Рекомендации по использованию научных выводов
8. Список использованной литературы
Приложения

в сыворотке крови. Забор крови для получения сыворотки проводили ПОДКОЖНО локтевой вены, используя вакуумные пробирки VACUETTE® (^Австрия) соответствующего типа. В дальнейшем кровь обрабатывали сог'лдасно наставлению VACUETTE® по получению сыворотки крови.
Образцы сыворотки были проанализированы на содержание ГЬС;<Зф с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа «Human —- q — CSF», производства фирмы «Invitrogen» (США)., Kat№KHC2031.
2.5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЗАРОДЫШЕВЫХ КЛЕТОК
2.5.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ STO КЛЕТОК
Клетки STO были любезно предоставлены Институтом биолопэц раз_ вития им. Н.К. Кольцова-РАН. Клетки, находились в 1,5 мл флакощах ддя криоконсервации в замороженном виде. Количество клеток во флакоыах ды_ ло неизменно и составляло 250 тыс.
Культивирование STO клеток происходило в среде DMEM + 10°/0 pgg (эмбриональная телячья сыворотка) (Sigma)+ глютамин + NEAA 1%-+- генто-мицин 5% + пируват натрия-1,5% + ЦистиаминТ,12%. Культивирование KJJe_ ток проводили в инкубаторе, обеспечивающим 95%-ную относительную влажность воздуха, температуру 38°С № содержание 7% С02 в воздухе (Sanyo, Япония).
Клетки оттаивали при температуре 40°С, на водяной бане, далее клетки соединяли со средой культивирования и переносили во флаконы для культивирования с площадью поверхности культивирования 25 см2.
Пассажирование клеток проводили на 6 - 7 сутки культивирования при 80%-100% плотности монослоя. Культуру клеток промывали 1 мл трипсин-ЭДТА (НПО «ПанЭко», Москва) и инкубировали с 0,25% раствором трип-син-ЭДТА при 38°С в течение 5 минут, пипетировали, клеточную суспензию собирали и рассевали по 2 флаконам для культивирования. В каждый флакон добавляли культуральную среду. Клетки культивировались до 2-3 пассажа