ДНК-микрочипы для генотипирования бета-лактамаз молекулярного класса А

• Автор: Уляшова, Мария Морисовна
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 197 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. УСТОЙЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ К БЕТАЛАКТАМНЫМ АНТИБИОТИКАМ

1.1. Беталактамные антибиотики.

1.2. Основные механизмы устойчивости микроорганизмов к беталактамным антибиотикам.

1.3. Классификация бсгалактамаз.

1.4. Разнообразие основных типов бсталактамаз расширенного спектра класса А.

1.5. Распространенность бсталактамаз расширенного спектра класса А

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ И ТИПИРОВАНИЯ БЕТАЛАКТАМАЗ

2.1. Фенотипические методы.
2.2. Генотипические методы.
ГЛАВА 3. ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НА ДИКМИКРОЧИПАХ.
3.1. Технологии изготовления ДНСмикрочипов.
3.2. Методы амплификации и включения метки в ДНК, используемые в технологии микрочипов.
3.3. Параметры, влияющие на гибридизацию на ДНКмикрочипах.
3.4. Детекция результатов гибридизации на ДНКмикрочипах.
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ГИБРИДИЗАЩОННОГО АНАЛИЗА НА ДНК
МИКРОЧИПАХ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БЕТАЛАКТАМАЗ
4.1. Микрочипы для идентификации генов беталактамаз.
4.2. Микрочипы для определения однонуклсотидного полиморфизма генов бсгалактамаз
4.3. ДНКмикрочипы для генотипирования бсталактамаз расширенного спектра
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА V. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
5.1. Реагенты и оборудование.
5.2. Методы исследования.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА 6. МЕТОД ГИБРИДИЗАЦИОННОГО АНАЛИЗА НА ДИКМИКРОЧИПАХ С КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
6.1. Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на поверхности стекла
6.2. Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на поверхности мембранных носителей
6.3. Выбор параметров печати микрочипов па стекле и мембранных носителях.
6.4. Оптимизация условий колориметрической детекции биотинмлированпой ДИК на поверхности микрочипов.
ГЛАВА 7. АМПЛИФИКАЦИЯ ГЕНОВ ТЕМ, V И СТХМ БЕТАЛАКТАМАЗ С ОДНОВРЕМЕННЫМ ВКЛЮЧЕНИЕМ МЕТКИ
7.1. Он пинпация выделения бактериальной ДНК
7.2. Выбор праймеров для амплификации полноразмерных генов ТЕМ, V и СТХМ бсталактамаз.
7.3. Оишмизация температуры отжига праймеров для амплификации генов беталактамаз ТЕМ, V и СТХМ типов.
7.4. Введение биотина в качестве метки в гены амплифицируемых беталактамаз в процессе мультиплексной ЦР
7.5. Мультиплексная ПЦР для амплификации генов беталактамаз ТЕМ, V и СТХМ типов.
ЛАВА 8. ДНКМИКРОЧИПЫ С КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ ДЛЯ ГЕИОТИПИРОВАНИЯ ТЕМ И V БЕТАЛАКТАМАЗ .
8.1. ДНКмикрочип с колориметрической детекцией для гспогипирования ТЕМ беталаю амаз
8.2. ДНКмикрочип с колориметрической детекцией для генотипиования V беталактамаз
ГЛАВА 9. ДНКМИКРОЧИП ДЛЯ ГЕИОТИПИРОВАНИЯ СТХМ БЕТАЛАКТАМАЗ
9.1. Анализ аминокислотных и кодирующих последовательностей СТХМ беталаю амаз
9.2. Молекулярный дизайн олигонуклеотидных зондов для определения
однонуклсотидного полиморфизма генов СТХМ бсталактамаз
9.3. Генотипирование СТХМ беталактамаз на ДНКмикрочипе
9.4. Апробация ДНКмикрочипа для генотипирования СТХМ беталактамаз при тестировании клинических штаммах микроорганизмов семейства
i
ГЛЛВА . ИНТЕГРИРОВАННЫЙ ДНКМИКРОЧИП ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БЕГЛЛАКТАМАЗ РАСШИРЕННОГО СПЕКТРА И ИНГИБИТОРРЕЗИСТЕНТНЫХ БЕТАЛАКТАМАЗ
9.1. Ключевые аминокислотные мутации в ТЕМ, IV и СТХМ бегал актам азах
9.2. Молекулярный дизайн зондов
9.3. Диагностика ТЕМ, 8НУ и СТХМ бетал актам аз и ключевых мутаций в них на интегрированном ДНКмикрочипе
9.5. Апробация олигонуклсотидного микрочипа на клинических штаммах микроорганизмов семейства КыегоЬисепасеае.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Мутации могут возникать достаточно быстро известны случаи, когда микроорганизмы становились нечувствительными к антибиотикам в течение курса лечения. Большинство известных беталактамаз проявляет выраженную структурную гомологию с ПСБ, что свидетельствует об эволюционной взаимосвязи между ферментами этих рупи . Подобно ПСБ беталактамазы, содержащие остаток серина в активном центре, взаимодействуют с беталактамными антибиотиками с образованием эфирного комплекса. Однако в случае беталактамаз этот комплекс быстро расщепляется с высвобождением нативного фермента и инактивированной молекул,I субстрата рис. За. Различия между бсталактамазами и ПСБ не всегда отчетливы, поскольку многие беталактамазы могут образовывать стабильные эфиры беталактамами, выступающими в роли ингибиторов, а некоторые СБ обладают способностью к быстрому деацилированию, проявляя слабую гидролитическую активность в отношении отдельных беталактамных антибиотиков . Лишь небольшое число ферментов, известных как металлобеталактамазы, гидролизируют беталактамное кольцо с участием ионов цинка, находящихся в активном центре рис. Для преодоления резистентности микроорганизмов, связанной с продукцией беталактамаз, как правило, используют два подхода. Первый основан на внедрение в клиническую практику беталактамов, устойчивых к гидролизу бсталактамазами. Другим эффективным подходом оказалось комбинирование пенициллинов и цефадоспоринов с так называемыми суицидными ингибиторами беталактамаз, представляющими собой тоже бсталактамные структуры, которые необратимо связываются с ферментами, тем самым подавляя их активность. В настоящее время клиническое значение имеют три ингибитора рис. Сегодня на долю ингибиторозащищенных пенициллинов приходится более половины назначений всех пенициллинов в европейских госпиталях . Сср. Н Н Ь Ч Vм . Гис. Механизмы расщепления беталактамных антибиотиков беталактамазами, содержащими серии и активном центре а и металлобеталактамазами б. Кл. ЮуЛЛМЯЛЯ М1ГЛТД
н А ,,
СИ
Сульбиктлм
У0
V
Гпюбпктом
Рис. Химические структуры ингибиторов бсталактамаз. В настоящее время известно более 0 различных беталактамаз и в последние годы ото количество стремительно растет до нескольких десятков в год. Перечисленные функциональные особенности послужили основой создания различных систем классификации беталактамаз . Актуальность дифференциации ферментов, предпочтительно гидролизующих пснициллины пснициллииаз или цефалоспорины цефалосиориназ. В г. По мерс накопления данных об аминокислотной последовательности фермеров вес большее значение стала приобретать классификация, основанная на сгруюурных особенностях беталактамаз общего уровня гомологии и наличия консервативных участков в первичной структуре ферментов, а также сходства пространственной структуры активного центра. Так. А, В, С и . Беталактам азы классов А, С и относятся к ферментам ссринового типа по аминокислоте, находящейся в активном центре фермента. Ферменты класса В относятся к металлоферментам, поскольку в качестве кофермеша в них присутсвуют один или два атома цинка. Прообразом современной классификации явилась предложенная в г. Эта система была уточнена и дополнена в г. Таблица 2. Г руппа по ВиэЬ Молеку лярный класс Микроорганизмы отсм Л о ка л и иило гена Предпочтительные субстраты Дсиствис ингибиторов кмавуланат с . ЭДТА и итак гам Основные представите. С Г ра чл рица тельные бактерии в основном, семейство ЕмегоЬаеепасеае хромосомы, редко плазмиды цефалоспорины поколений в меньшей степени псницидлины нет нет АтрС. С Е. А Грамположитсльныс бактерии йнхрИососсия Брр. Ь А Грамотрниагельние бактерии в основном, семейство ЕтегоЬа сгеНасеае плазмиды, редко хромосомы псницидлины. Ьг А Грамотриаателтые бактерии в основном, семейство ЕтсгоЬасспасеас плазмиды природные и полусинтетическме псницидлины. Ьсг А Грамотрииатсльныс бактерии в основном, семейство ЕЫегоЪасепасеае плазмиды цефалоспорины поколений и монобактамы наряду с ранними цефадоспоринами и пенициллинами нет нет ТЕМ

Таблица 2 продолжение. Ми. НК i . I i 1 iI i хозяева 1 сна . Щ 1 1 i
i i. ОХА ОХА
i iii. ОХА
ОХА
vi.