Теоретические и экспериментальные подходы для изучения механизмов транспорта цисплатина в клетки с помощью белка CTR1

• Автор: Затуловский, Евгений Аркадьевич
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 146 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1, ОШР.РД ИТЕЕАТУРЬД

1.1. Биологическая роль меди в организме

1.1.1. Биологические функции меди

1.1.2. Метаболическая система меди МСМ

1.2. Физикохимические свойства ионов меди

1.2.1. Образование координационных связей и концепция Пирсона.

1.2.2. Ионы меди Си1 и СиП

1.2.3. РОЛЬСОСТАЗД И ГЕОМЕТРИИ КООРДИНАЦИОННОЙ СФЕРЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ СТЕПЕНИ ОКИСЛЕНИЯ ИОНА МЕДИ.

1.2.4 СХОДСТВА И РАЗЛИЧИЯ КООРДИНАЦИОННЫХ СВОЙСТВ МЕДИ И СЕРЕБРА

1.3. Трансмембранный МЕДЬТРАНСПОРТНЫЙ ВЕЛОК СТК1

1.3.1. ОСНОПНЫЕ ПУТИ ТРАНСПОРТА ИОНОВ МЕДИ ЧЕРЕЗ ПЛАЗМАТИЧЕСКУЮ МЕМБРАНУ КЛЕТКИ
1.3.2. Топология и функциональные характеристики семейства белков СТЯ1
1.3.3. Физиологическая роль СТШ у позвоночных животных
1.3.4. Белок СТ1 человека
1.3.5. Взаимодействие ионоз меди с доменами СТЯ1
1.3.6. Участие СТ1и в транспорте платиновых противоопухолевых препаратов 1.4. Экспериментальные модели для изучения метаболической системы меди МСМ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Оборудование
2.2. Материалы
2.2.1. Лабораторные животные и клеточные линии
2.2.2. Антитела
2.2.3. Реагенты
2.3. Компьютерные методы
2.4. Экспериментальные методы
2.4.1. Выделение тотальной РНК.
2.4.2. Обратная транскрипция, сопряжнная с полимеразной цепной реакцией.
2.4.3. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.
2.4.4. Полуколичествпнный метод определения квазистационарного уровня мРНК.
2.4.5. Иммуноблотинг.
2.4.6. Выявление оксидазной активности в геле.
2.4.7. Выявление ферроксидазной активности в геле.
2.4.8. Выявление активности СОД в геле.
2.4.9. Анализ препарата растворимых белков цистернального пространства мембран АППАРАТА ГОЛЬДЖИ.
2.4 Выделение очищенного препарата церулоплазмина.
2.4 Измерение УФспектров поглощения.
2.4 Измерение спектров кругового дихроизма.
2.4 Измерение кривых плавления.
2.4 Измерение скорости ферментативного окисления ортодианизидина очищенными ПРЕПАРАТАМИ ЦП.
2.4 Разделение внутриклеточных фракций методом равновесного
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ.
2.4 Определение количества живых клеток в культуре методом МТТлнллизл.
2.4 Флуоресцентная микроскопия.
2.4 Полярографическое измерение активности цитохромсоксидазы.
2.4 Измерение концентраций меди, серевра и платины.
з,щуль1А1ыютоъсттщбз
3.1. Идентификация и вычленение сайтов в белке 1 на основе данных, полученных
МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ЭВОЛЮЦИИ
3.1.1. Анализ концевого домена белка 1 позвоночных нл основе данных молекулярной эволюции
3.1.2. Докинг медьсвязывающих мотивов 1 млекопитающих с предполагаемыми донорами меди
3.1.3. Модель, объясняющая транспорт платиновых комплексов через
3.2. Модель животных с искусственно изменяемым статусом меди
3.2.1. Приготовление
3.2.2. Динамика действия диеты на статус меди у лабораторных грызунов
3.2.3. Выделение и анализ ЦП из крови крыс
3.2.4. Распределение серебра организме грызунов
3.2.5. МСМ клеток печени мышей
3.2.6. Однократное введение сульфата меди Лс,животным стремительно восстанавливает статус меди
3.3. Влияние дефицита внеклеточной меди на транспорт и активность циг.платина
3.3.1. Использование мышей для изучения влияния дефицита меди, ассоциированного с ЦП, нл скорость роста опухолей различного происхождения
3.3.2. Влияние статуса меди нл рост клеток и цитостатический эффект циспллтинл
I VI
3.3.3. Влияние статуса меди на распределение циспллтинл в организме мышей i viv
3.3.4. Экспрессия гена 1 в различных органах мышей и распределение меди, серебра и платины в этих ОРГАНАХ
4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
5, ВЫЗОЛЫ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


В результате развиваются тяжелые формы анемии, дефекты сосудов, гипопигментация волос, изменения структуры костной ткани, нарушения деятельности ЦНС, нарушение обмена липидов, синтеза пептидных гормонов, болезни Менкеса и Вильсона, болезнь Альцгеймера, прионная болезнь, амиотрофический латеральный склероз, рак, остеопороз и др. Безопасный перенос ионов меди осуществляют белки специальной системы метаболической системы меди МСМ. Системы, обеспечивающие безопасный перенос меди внутри клетки, сходны у всех эукариотов и ортологичны соответствующим система у прокариотов Репа . Пучкова, Платонова, i . Клонирование генов МСМ, принадлежащих различным организмам, сравнительный анализ аминокислотных последовательностей, биохимическая характеристика рекомбинантных белков, кодируемых этими генами, а также исследования, проведенные на организмах с природным или экспериментальным недостатком или полным отсутствием белков, участвующих в метаболизме меди, позволило выявить общие принципы работы этих систем. Оказалось, что все МСМ клеток филогенетически удаленных организмов организованы по сходному плану. Рис. Клеточный механизм транспорта меди у высших эукариотов. Доставка меди в клетки нсгспатоцитарных рядов осуществляется церулоплазмином. К гепатоцитарным клеткам ионы меди доставляются в комплексе i. В клетке они предположительно связываются с цитоплазматическими , СОХ , АТОХ1 или мембранными АТР7А в клетках нсгспатоцитарных и АТР7В в клетках гепатоцитарных рядов шаперонами, которые переносят их на секретируемые купроэнзимы или выкачивают их из клетки. Глутатион , мсталлотинонеин МТ и белок 1, возможно, участвуют в поддержании гомеостаза меди в оксилительновосстановительном цикл. Все МСМ включают интегральные белки плазматической мембраны, транспортирующие медь в клетку цитозольные и ассоциированные с мембраной шапероны, которые переносят медь в активные центры ферментов, и межклеточные транспортеры ионов меди рис. Уже у бактерий существует консервативная для трех царств МСМ i, v, , v, . В этой системе Сор оперон кодирует 4 белка СорА, СорВ, , , которые соответственно выполняют функции мембранного транспортера меди внутрь клетки, выведения меди из клетки, репрессии медного оперона в ответ на повышение концентрации меди в клетке и медного вну триклеточного шаперона . У высших эукариотов в клетках различных органов одного и того же организма МСМ отличаются но набору белков и уровню их экспрессии. Более того, в течение онтогенеза в клетках одного и того же органа может изменяться тип МСМ i, i, . У млекопитающих медь преимущественно всасывается в тонкой кишке в виде ионов, получающихся в результате диссоциации растворимых солей и разрушения медьсодержащих белков, поступающих с пищей. Количество поглощаемой таким образом меди у взрослых млекопитающих регулируется ее содержанием в шнце, при этом изменяется уровень экспрессии генов, участвующих в метаболизме меди, в клетках эпителия , . При повышении содержания меди в пище ее сорбция уменьшается, а при уменьшении увеличивается. Выведение меди из организма осуществляется главным образом через желчь при помощи белка 1, также известного как 1 , . Печень является центральным органом гомеостаза меди. Медь, адсорбированная в тонкой кишке, сразу переносится к печени. Вначале она входит в комплекс с альбумином как II, а затем координируется двумя свободными молекулами гистидина также в состоянии II , , . Только из этого комплекса ионы меди передаются в гспатоциты , . При этом молекулы гистидина в клетки не поступают. В печени медь разделяется на три пула. Вопервых, она включается в купроэнзимы СОД, цитохромСоксидаза, ЦП и т. Хсцепленный ингибитор апоптоза XI, который участвует в процессе деградации белка 1, тем самым, регулируя выведение меди из печени в желчь i , . Вовторых, поступившие ионы меди с помощью ЛТФазы Вильсона АТР7В включаются в ЦПК тому же ЦП, связанный с мембраной через гликозилфосфатидил инозитоловый якорь ГФИЦГ, и гефестин обладают ферроксидазной активностью и являются важными участниками в транспорте железа в клетки и его мобилизации из клеточных депо v , .