Гидрокортизоновые производные в качестве векторов доставки генетических конструкций в животные клетки

• Автор: Савищенко, Елена Анатольевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 127 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

Современные представления о возможности коррекции 13 патологических состояний путем введения в организм генетической информации - генная терапия

1.1 Вирусные способы доставки целевых генов

1.1.1 Векторы на основе ретровирусов

1.1.2 Аденовирусные векторы

1.1.3 Аденоассоциированные вирусы

1.1.4 Вирус простого герпеса

1.1.5 Практическое применение вирусных конструкций

1.2 Невирусные способы доставки генетического материала
1.2.1 Липосомы как векторы доставки ДНК
1.2.2 Рецепторно-опосредованный способ доставки 26 ДНК- конструкций
1.2.3 Принципы конструирования систем для трансфекции 33 плазмидными ДНК по механизму рецепторного эндоцитоза
1.3 Гидрокортизон в качестве лиганда - вектора для трансфекции
1.3.1 Рецепторы гидрокортизона
1.4 Наночастицы на основе поликатионов и специфических 43 лигандов
1.4.1 Химические методы синтеза конъюгатов на основе лигандов 43 специфических рецепторов и ДНК-связывающих соединений
1.4.2 Характеристика наночастиц, содержащих лоликатионы и 50 специфические лиганды
1.4.3 Физико-химические свойства наночастиц для трансфекции

Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Выделение плазмидной ДНК
2.2 Электрофорез плазмидной ДНК
2.3 Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия
2.4 Получение конъюгатов гидрокортизон-полилизин, 63 гидрокортизон-полиэтиленимин и гидрокортизон-протампн
2.4.1 Синтез конъюгата гидрокортизон-полилизин
2.4.2 Синтез конъюгата гидрокортизон-полиэтиленимин
2.4.3 Синтез гидрокортизонового производного протамина
2.5 Хроматографический анализ конъюгатов
2.6 Формирование трехкомпонентных комплексов 67 ДНК-носитель-лактоферрин
2.7 Электрофоретический анализ комплексов плазмидной ДНК 68 с конъюгатами
2.8 Определение размеров наночастиц флуоресцентным методом
2.9 Анализ размера наночастиц при помощи светорассеяния
2.10 Трансфекция эукариотических клеток в культуре
2.11 Трансфекция лабораторных животных наночастицами на основе 70 модифицированных полимерных носителей
2.11.1 Метод выявления флуоресцентных белков
2.11.2 Метод выявление активности бета-галактозидазы в клетках 71 органов
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Синтез гидрокортизоновых производных катионных 73 полимеров
3.1.1 Синтез производных на основе полилизина
3.1.2 Синтез производных на основе полиэтиленимина
3.1.3 Синтез производных на основе протамина

3.1.4. Хроматографиеский анализ полученных производных полилизина, полиэтиленимина и протамина
3.1.5 Определение соотношения гидрокортизон/полиэтиленимин, гидрокортизон/полилизин и гидрокортизон/протамин в синтезированных конъюгатах
3.2 Анализ взаимодействия производных полилизина, полиэтиленимина и прогамина с плазмидными ДНК
3.2.1 Формирование комплекса плазмидная ДНК - носитель и оценка его свойств
3.3 Трансфекция комплексами плазмидных ДНК эукариотических клеток в культурах
3.4 Определение размеров наночастиц
3.4.1 Определение относительного размера комплексов по связыванию бромистого этидия
3.4.2 Влияние лактоферрина на размеры комплексов модифицированного протамина с ДНК
3.4.3 Определение размеров комплексов при помощи светорассеяния на лазерном корреляционном спектрометре
3.5. Трансфекция полученными векторами эукариотических клеток in vivo
Глава 4. Обсуждение
Выводы
Список литературы
рецепторных систем для трансфекции. В то же время использование ЛФ может способствовать формированию комплексов - наночастиц требуемого размера.
Особой задачей трансфекции является возможность специфически воздействовать на определенные клетки или же вызывать экспрессию генов в заданных клетках. Это может достигаться либо путем использования определенных лигандов, либо путем введения в ДНК-конструкцию специфических промоторов. Данный подход особенно важен для генной терапии опухолевых процессов, где клеточная специфичность является весьма важным элементом.
Исследования в области создания невирусных векторов для генной терапии in vivo показали необходимость формирования ДНК-связывающих конъюгатов на основе нескольких соединений с различной функциональной активностью. По современным представлениям эти конъюгаты должны содержать ДНК-компактизирующую часть (поликатионы), лиганды интернализующих рецепторов, сигналы, препятствующие включению комплексов в лизосомы, и сигналы ядерной доставки. Конъюгаты подобного рода обладают следующими преимуществами:
• Тканеспецифические лиганды определяют тип трансфецируемых клеток;
• Способны трансфецировать различные клетки независимо от их пролиферативной активности;
• Не имеют ограничений в размерах или типах вводимых нуклеиновых кислот;
• Не содержат интактных вирусных компонентов, в том числе и вирусных белков, и поэтому безопасны для реципиента;
• Полностью лишены антигенной активности и могут использоваться повторно неограниченное число раз;