Влияние аналогов малых ядрышковых РНК на экспрессию генов человека

• Автор: Степанов, Григорий Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 УЧАСТИЕ МАЛЫХ ЯДРЫШКОВЫХ РНК В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Введение

1.2. Структура малых ядрышковых РНК

1.2.1 Структурные особенности малых ядрышковых C/D-бокс-РНК

1.2.2 Структурные особенности малых ядрышковых Н/АСА-бокс-РНК

1.2.3 Разнообразие форм РНК, содержащих С/D- и Н/АСА-боксы

1.2.4 Организация генов, кодирующих малые ядрышковые РНК
1.3 Состав и структура рибонуклеопротеидов, осуществляющих 2’-0-метилирование
нуклеотидов рРНК
1.4. Участие C/D-бокс-РНК в процессинге РНК клеток эукариот
1.4.1 Участие C/D-бокс-РНК в сайт-специфичном 2’-0-метилировании нуклеотидов рибосомных РНК
1.4.2 Функциональная роль 2’-0-метилированных нуклеотидов в составе рибосомных РНК клеток эукариот
1.4.3 Участие C/D-бокс-РНК в пост-транскрипционном созревании пре-мРНК и регуляции трансляции мРНК
1.4.3.1 Процессинг C/D-бокс-РНК до коротких форм и их участие в регуляции экспрессии генов
1.4.3.2 Участие C/D-бокс-РНК в жизненном цикле вируса Эпштейна-Барра
1.5 Искусственные ДНК-конструкции, кодирующие C/D-бокс-РНК, направленные на нарушение сплайсинга пре-мРНК
1.6 Методы выявления 2’-0-метилированных нуклеотидов в составе клеточных РНК
1.7. Изменение уровня экспрессии малых ядрышковых РНК при заболеваниях человека
1.8 Заключение
ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы и реактивы
2.2 Ферменты
2.3 Олигодезоксирибонуклеотиды
2.3.1 Олигодезоксирибонуклеотиды, используемые для ОТ рРНК клеток человека

2.3.2 Олигодезоксирибонуклеотиды, используемые для ген-специфичного ОТ-ПЦР суммарной РНК клеток человека
2.3.3 Олигодезоксирибонуклеотиды, используемые для синтеза ДНК-матриц аналогов C/D-бокс-РНК
2.3 Олигорибонукпеотиды
2.4 Буферные смеси
2.5 Методы
2.5.1 Конструирование и синтез аналогов СЯ)-бокс-РНК
2.5.2 Введение [32Р]-метки по 5’-концу нуклеиновых кислот
2.5.3 Культуры клеток
2.5.4 Трансфекция клеток MCF-7 синтетическими РНК
2.5.5 Выделение суммарной РНК клеток человека
2.5.6 Выделение РНК из цитоплазматической и ядерной фракций клеток MCF-
2.5.7 Выявление 2’-0-метилированных нуклеотидов в составе рРНК клеток человека
2.5.8 Определение первичной структуры рРНК клеток человека
2.5.9 Анализ накопления флуоресцентно меченой РНК в клетках MCF-
2.5.11 Анализ стабильности аналогов C/D-бокс-РНК в клетках человека
2.5.12 Анализ изменения уровня мРНК в клетках человека, трансфицированных аналогами C/D-бокс-РНК
2.5.13 Анализ проапототических изменений цитоплазматической мембраны клеток человека MCF-7
2.5.14 Определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста
2.5.15 Подготовка препаратов суммарной РНК клеток MCF-7 для анализа экспрессии генов на
чипе Illumina НТ-12. Первичный и вторичный анализ данных гибридизации
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Структура и синтез аналогов C/D-бокс-РНК человека
3.2 Анализ накопления и локализации синтетических аналогов C/D-бокс-РНК в клетках человека
3.3 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на 2’-0-метилирование рибосомных РНК клеток человека
3.3.1 Модификация метода выявления 2’-0-метилированных нуклеотидов РНК
3.3.2 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на de novo 2’-0-метилирование нуклеотидов рРНК
3.3.3 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на глубину природного 2’-0-метилирования
нуклеотидов рРНК клеток человека
3.4 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на сплайсинг пре-мРНК гена HSPA
3.5 Анализ цитотоксического действия синтетических C/D-бокс-РНК на клетки человека в культуре
3.5.1 Сравнительный анализ влияния аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток MCF-
3.5.2 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток человека в сочетании с цитотоксическими агентами
3.6 Изменения транскриптома клеток человека MCF-7 под действием C/D-бокс-РНК
3.6.1 Функциональный анализ изменения экспрессии генов клеток MCF-7, трансфицированных аналогами C/D-бокс-РНК
3.6.2 Активация транскрипции интерферон-стимулируемых генов под действием синтетических аналогов C/D-бокс-РНК
3.6.3 Повышение уровня мРНК проапоптотических генов в клетках MCF-7, трансфицированных синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК
3.6.4 Особенности структуры синтетических аналогов C/D-бокс-РНК, влияющие на активацию транскрипции генов врожденного иммунного ответа
3.6.5 Механизмы понижения уровня экспрессии генов при трансфекции клеток MCF-7 синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

экзон I интрон экзон II 5-І га ди ^-адИ ЬЗ' -
ЭКЗОН I
нуклеотид донорного )( нуклеотид акцепторного сайта сплайсинга [] сайта сплайсинга
аденозин точки разветвления сплайсинга
-адС_ интрон экзон II
экзон I экзон II

з—ад -3 интрон
Рис. 8. Схема вырезания интрона при сплайсинге пре-мРНК. (А) Общая схема процесса. (Б) Первый этап сплайсинга. (В) Второй этап сплайсинга. (Г) Структура лассо интрона, образующаяся в результате сплайсинга.