Влияние комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I на копирование ДНК эукариот

• Автор: Базалук, Виталина Витальевна
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 152 с. : ил.

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Взаимодействие ДНК со стероидными гормонами и АпоА

1.2. Копирование ДНК.

1.2.1. Репликация

1.2.2. Ферменты репликации.

1.3. Метилирование.

1.3.1. Общие сведения

1.3.2. Метилирование ДНК во время эмбриогенеза.

1.3.3. Метилирование генома млекопитающих

1.3.4. Этапы метилирования генома.

1.3.5. ДНКметилтрансферазы
1.3.6. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина
1.3.7. Связь метилирования ДНК с регуляцией экспрессии генов.
1.3.8. Нарушения метилирования ДНК при старении клеток и
канцерогенезе
1.4. Гепатэктомия. Регенерация тканей. Пролиферация клеток.
Заключение.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы, биологические объекты и оборудование.
2.2. Методы исследований.
2.2.1. Выделение ДНК с использованием гуанидиний изотиоционата
2.2.2. Анализ выделенной ДНК в агарозном геле
2.2.3. Выделение ядер и белкового экстракта из ядер клеток печени крыс
2.2.4. Выделение хроматина из клеток печени крыс.
2.2.5. Получение комплекса стероидАпоА
2.2.6. Взаимодействие ДНК с комплексами стероидАпоА1.
2.2.7. Копирование ДНК крысы при помощи полимераз белкового экстракта из ядер клеток печени крыс БЯЭ .
2.2.8. Копирование ДНК человека с помощью фрагмента Клнова.
2.2.9 Копирование ДНК крысы в составе хроматина с помощью фрагмента Клнова .
2.2 Копирование ДНК крысы с помощью фрагмента Клнова с дополнительной обработкой ДНКазой I .
2.2 ГидролизД1К нуклеазой Б1.
2.2 Получение Рдуплексов из комплементарных олигонуклеотидов.
2.2 Метилирование ДНК.и олигонуклеотидных дуплексов. .
2.2 Л 4. Расщепление метилированной ДНК эндонуклеазой рестрикции Рзр4нт. . . . .
2.2 Гидролизолигонуклеотидов ДНКазой I . .
2.2 Сканирование фотоплнок и радиоавтографов
2.2 Статистическая обработка данных исследования.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
З.Г. Характеристика препаратов аполинопротеинаА1, ДНК, хроматина и
белкового экстракта из ядер клеток печени крысы. .
3.1.1 .Характеристика нативной ДНК .
3.1.2. Присутствие однонитевых участков в нативной ДНК.
.3., Характеристика АпоАГ. .
ЗЛ .4. Характеристика белкового экстракта из ядер клеток печени крысы.
3.1.5. Характеристика хроматина из ядер клеток печени крысы.
3.1.6. Взаимодействие ДНК с комплексами АпоА1 стероид .
Копирование.ДНК, катализируемое фрагментом Кленова и ДНКполимеразами БЯЭ. ,. .
3.2.1. Копирование ДНК,.катализируемое фрагментом Кленова.
3.2.2. Размеры копированных фрагментов ДНК. Л.
3.2.3. Копирование ДНК крысы при помощи белкового экстракта из ядер
. клеток печени крыс БЯЭ. . .
. з
3.2.4. Влияние комплекса ТГКАпоА1 на гидролиз ДИК человека нуклеазой
3.2.5. Влияние ДНКазы I на копирование ДНК в присутствии и в отсутствие комплекса ТГКАпоА1.
3.2.6. Копирование ДНК в составе хроматина.
3.3. Метилирование ДНК и олигонуклеотидных дуплексов.
3.3.1. Получение дуплексов из комплементарных олигонуклеотидов
3.3.2. Связывание олигонуклеотидов и их дуплексов с комплексами стероидный гормонАпоА1.
3.3.3. Влияние метилирования на взаимодействие олигонуклеотидов, их комплементарных дуплексов и ДНК с комплексом ТГКАпоА1.
3.3.4. Влияние метилирования на копирование ДНК.
3.3.5. Копирование ДНК из печени гепатэктамированных крыс
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Активация копирования ДНК в присутствии
комплекса ТГКАпоА1.
4.2. Копирование ДНК крысы в составе хроматина, катализируемое фрагментом Кленова и ДНКполимеразами из белкового экстракта ядер клеток в присутствии комплексов ТГКАпоА1 и кортизолАпоА
4.3. Влияние метилирования на взаимодействие олигонуклеотидных дуплексов с комплексами стероидАпоА
4.4. Влияние метилирования на структуру и функции ДНК
4.5. Влияние комплексов стероидный гормонАпоА1 на копирование метилированной и деметилированной ДНК из печени
гепатэктомированной крысы
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Изучение механизма взаимодействия дуплекса 5 с тетрагидрокоргизолом и комплексом тетрагидрокортизолАпоА1 с помощью инфракрасной спектроскопии показало, что в данном случае происходит образование водородных связей между ОНгруппой в 3ем положении Акольца гормона и с С0группой цитозина или гуанина. Кроме того, оказалось, что тетрагидрокортизол образует водородные связи с фосфатной группой дуплекса и ОНгруппой моносахарида. При действии одного гормона отмечался структурный переход типа порядок порядок при действии комплекса тетрагидрокортизолАпоА1 происходил структурный переход типа порядок беспорядок i . Ранее в работе Панина с соавт. Панин I. Е. и др. ЛПВПз кооперативно захватываются макрофагами, в которых происходит восстановление кетогруппы в положении 3 и двойной связи в 5ом положении кольца гормона при участии 5а и 5рредуктаз с образованием тстрагидрокортизола. Затем происходит также процесс дезинтеграции ЛПВП3 с освобождением аполипопротеина А1. Панин Л. Е. и др. Далее комплекс рецептируется соматическими клетками и переносится в ядро, где взаимодействует с депротеинизированными участками ДНК. В депротеинизации ДНК принимают участие лизосомальные протеиназы макрофагов, которые вместе с комплексом проникают в ядра соматических клеток. В данном механизме АпоАI играет роль адресного переносчика восстановленных стероидных гормонов к сайтам связывания с ДНК. Было показано связывание АпоАI с нативной ДНК эукариот и синтетическими олигонуклеотидами с константой ассоциации 6 М1 с использованием метода аффинной модификации Гимаутдинова О. И. и др. Но значительное воздействие на вторичную структуру ДНК обнаруживалось только при инкубации с комплексами стероидный гормонАпоАI, где стероидный гормон тетрагидрокортизол, андростерон, дегидроэпиандростерон и его сульфат. Воздействие заключалось в локальном плавлении расплетении двойной цепи ДНК в сайтах связывания указанных комплексов. Гимаутдинова О. И., Панин 1, , ферментативным анализом Панин Л. Е. и др. Гимаутдинова О. И. и др. Панин Л. Е., Тузиков Ф. В. и др. Роль тетрагидрокортизола связана с разрывом водородных связей между парами азотистых оснований и подготовкой ДНК к взаимодействию с РНКполимеразой. Это приводит, в конечном счете, к активации экспрессии генов и усилению биосинтеза белка в клетке Панин Л. Е. и др. Усынин И. Ф., , . Показано, что все стероидные гормоны, содержащие 3гидроксигруппу в кольце, в комплексе с аполипопротеииом I увеличивают скорость биосинтеза белка в культуре гепатоцитов крыс. Для проявления биологического эффекта гормона более предпочтительной является циспозиция ОНгруппы. Так, дегидроэпиандростеронсульфат в комплексе с аполипопротеином I повышает скорость биосинтеза белка в культуре гепатоцитов крыс, что подтверждает участие этого гормона в регуляции экспрессии генов Панин I и др. Данный механизм играет важную роль и в регуляции экспрессии генов в опухолевых клетках. Однако, в них он проявляется с некоторыми особенностями. Методами дискэлекгрофореза и иммуноэлектроблотгинга показаны различия в поглощении и, повидимому, метаболической деградации белкового компонента липопротсинов высокой плотности нормальных и опухолевых клеток. В качестве нормальных клеток использовались перитонеальные макрофаги мышей линии А , в качестве опухолевых клетки гепатомы НА1. Обнаружено снижение поглощения макрофагами аполипопротеииа АI при опухолевом росте. Спектр внутриклеточных белков у них значительно отличался от нормальных клеток. В опухолевых макрофагах оказалось, сниженным содержание низкомолекулярных белков 6 к Да и повышенным содержание белков со средней и высокой молекулярной массой, что указывает на нарушение механизмов внутриклеточной деградации. Комплекс тетрагидрокортизолаполипопротеин АI захватывался более активно, чем аполипопротеин I как нормальными, так и опухолевыми клетками. Однако, в опухолевых клетках эффект был более выраженным. Отмечено увеличение содержания продуктов метаболической деградации этого белка под влиянием гормона Русских Г. С. и др. Опыты i vi на изолированной ДНК крысы продемонстрировали способность комплекса тетрагидрокортизолАпоАI в зависимости от его концентрации как активировать, так и полностью подавлять процесс транскрипции, в то время как комплекс кортизолАпоАI такой способностью не обладал iiv . I. . Величко , .