Взаимодействие поли(ADP-рибоза)полимераз 1 и 2 с ДНК-интермедиатами эксцизионной репарации оснований

• Автор: Кутузов, Михаил Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 157 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений Введение
Глава 1 Литературный обзор
1Л Поли(АОР-рибозил)ирование и метаболизм поли(АОР-рибозы)
1.2 Семейство РАЯР
1.2.1 РАЯР, активность которых зависит от повреждений ДНК
1.2.2 Танкиразы
1.2.3 Белки РАЯР, содержащие цинковые пальцы СССН-типа
1.2.4 РАЯР, содержащие макродомен
1.2.5 Другие представители семейства РАЯР
1.3 Особенности структурной организации РАЯР
1.4 Роль РАЯР2 в репарации ДНК
1.5 Роль РАЯР2 в сохранении целостности гетерохроматина
1.5.1 Роль РАЯР2 в сохранении целостности центромерного гетерохроматина
1.5.2 Роль РАЯР2 в сохранении целостности теломерного гетерохроматина
1.5.3 Роль РАЯР2 в сохранении целостности факультативного гетерохроматина
1.6 Специфические функции РАЯР2 в процессе дифференцировки
1.6.1 РАЯР2 участвует в контроле дифференцировки половых клеток самцов
1.6.2 РАЯР2 принимает участие в контроле дифференцировки и морфогенеза
1.6.3 РАЯР2 необходима для нормального развития Т-лимфоцитов
1.7 Роль РАЯР2 в воспалительном ответе
1.8 Перспективы ингибирования РАЯР
1.9 Апуриновые/апиримидиновые сайты в составе кластерных повреждений ДНК и их репарация
1.10 Заключение Глава 2 Материалы и методы
2.1 Материалы
2.2 Методы
2.2.1 Выделение РАЯР
2.2.2 Введение [32Р]-метки в 5'(3')-конец олигонуклеотида и формирование ДНК-дуплексов
2.2.3 Электрофорез ДНК в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.4 Электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях
2.2.5 Электрофорез белков по методу Лэммли
2.2.6 Количественная обработка распределения радиоактивности в гелях
2.2.7 Измерение концентрации белка по методу Бредфорд
2.2.8 Получение ДНК-дуплексов, содержащих АР-еайты
2.2.9 Модификация белков ДНК-дуплексами, содержащими АР-сайт, в реконструированных системах
2.2.10 Определение АР-эндонуклеазной активности АРЕ
2.2.11 Выявление белок-белковых взаимодействий методом коиммунопреципитации
2.2.12 Выявление белок-белковых взаимодействий методом

сшивок глутаровым альдегидом
2.2.13 Изучение кинетики поли(АОР-рибозил)ирования с использованием радиоактивномеченого NAD+
2.2.14 Получение кольцевой двухцепочечной ДНК, содержащей АР-сайты и метку 32Р
2.2.15 Модификация белков клеточных экстрактов АР-ДНК
2.2.16 Влияние PARP1/PARP2 и XRCC1 на ДНК-полимеразную активность роф
2.2.17 Влияние PARP1 и PARP2 на активность FEN
2.2.18 Оценка стабильности аддуктов белок-ДНК
2.2.19 Идентификация белков методом иммуноблоттинга
2.2.20 Определение значения Кд комплекса PARP-ДНК методом задержки в геле
2.2.21 Приготовление клеточных экстрактов
2.2.22 Выявление АР-лиазной активности PARP1/
2.2.23 Выявление 5'-с1КР-лиазной активности PARPI/
2.2.24 Влияние PARP1/PARP2 на расщепление АР-ДНК АР-эндонуклеазой
2.2.25 Создание ДНК-структур, с bio-dUMP на З'-конце dUMP-содержащей цепи (Ыо-АР-ДНК)
2.2.26 MALDI-TOF-MS анализ
2.2.27 Приготовление лигированной ДНК с двумя шпильками
2.2.28. Синтез фотоактивируемых ДНК, катализируемый pol Р
2.2.29. Фотоаффинная модификация белков Глава 3 Результаты и обсуждение
3.1 Выделение PARP
3.2 Взаимодействие PARP1 и PARP2 с ДНК, содержащей АР-сайты
3.2.1 Исследование взаимодействия PARP1 клеточных экстрактов с АР-ДНК
3.2.2 Исследование взаимодействия рекомбинантной PARP1 с АР-ДНК
3.2.3 Изучение активации PARP1 при взаимодействии с АР-ДНК
3.2.4 Изучение стабильности адцукта PARPI -АР-ДНК
3.2.5 Исследование взаимодействия АРЕ1 и PARP1 в присутствии АР-ДНК
3.2.6 Выявление белок-белковых взаимодействий между PARP1 и АРЕ
3.2.7 Исследование взаимодействия рекомбинантной PARP2 с АР-ДНК
3.2.8 Изучение стабильности аддукта РАКР2-АР-Д] !К
3.2.9 Изучение влияния PARP2 на активность АРЕ
3.3 Взаимодействие PARP1 и PARP2 с АР-сайтами в составе
кластерных повреждений
3.3.1 Ненуклеотидные вставки как аналоги АР-сайтов
3.3.2 Изучение модификации PARP1 АР//Х-ДНК
3.3.3 Влияние PARP1 на эффективность расщепления АР-
эндонуклеазой 1 АР-сайта в составе кластерного
повреждения
3.3.4 Определение кофакторных характеристик ионов Са2+ в реакциях автополи(АОР-рибозил)ирования PARP1 и расщепления АР-сайтов АРЕ
3.3.5 Исследование влияния АРЕ1 на уровень модификации

РАЯР1 АР//Х-ДНК
3.3.6 Изучение специфичности взаимодействия РАЯР1/2 с ДНК, 110 несущими кластерные повреждения
3.4 Взаимодействие РАЮ3 2 с ДНК-интермедиатами репарации, 114 сравнительный анализ влияния PAR.P1 и РАКР2 на некоторые белки
эксцизионной репарации оснований
3.4.1 Оценка сродства РАЯР2 к ДНК-интермедиатам репарации
3.4.2 Сравнительный анализ эффективности активации РАЯР1 и
РАЯР
3.4.3 Исследование влияния РАКР1 и РАЯР2 на ДНК-
полимеразную активность роф
3.4.4 Изучение функционального взаимодействия Р.АКР1 и
РАЯР2сРЕМ
Выводы
Список литературы

Раздел 1.7. Роль PARP2 в воспалительном ответе
На данный момент известно большое количество данных, свидетельствующих, что дефицит PARPI приводит к снижению воспалительного ответа в различных патофизиологических условиях, таких как зндотоксический шок, ишемия, хронический колит и острый панкреатит [36, 51, 56, 133]. Участие PARP1 в регуляции экспрессии генов белков, вовлеченных в воспалительный ответ [134, 135], а также ее гиперактивация, приводящая к расходованию NAD+ и снижению уровня АТР [36], предположительно являются базовыми механизмами, которые связывают PARP1 с воспалительным ответом. Спад уровня клеточного NAD+ может привести к некрозу клетки. В цсльноклеточных экстрактах, полученных из Рагр2'/_ клеток, обработанных NMU, которая индуцирует разрывы ДНК, общий уровень активности PARP был снижен лишь на 5-10% по сравнению с экстрактами Рагр2+/+ клеток [14]. При этом, неизвестно может ли такое малое снижение оказать какой-либо эффект на воспалительный процесс и на некроз ткани, В дополнение было показано, что фактор индукции апоптоза (AIF) после активации PARP1 высвобождается из митохондрий и транслоцируется в ядро. Находясь в ядре, AIF вызывает конденсацию хроматина, фрагментацию ДНК и р53-независимую гибель клетки. Примечательно, что только активность PARP1 (но не PARP2) приводит к индукции апоптоза, обусловленного AIF [52].
Остается невыясненной роль PARP2 в регуляции транскрипции генов белков, участвующих в воспалительном ответе. Известны лишь некоторые данные об участии PARP2 в этом процессе [51, 57], однако результаты, полученные на разных моделях, различаются. Известно, что для мышей дефицитных по интерлейкину IL-10 характерны колиты и рак ободочной и прямой кишок. Снижение уровня экспрессии Рагр2 специфическими антисмысловыми олигонуклеотидами у мышей, дефицитных по IL-10, приводит к существенному ослаблению колитов в сравнении с контрольными мышами [57]. Эти результаты подтверждают роль PARP2 в воспалительном ответе. В то же время, данные, полученные из экспериментов на мышах, дефицитных по Рагр2, свидетельствуют о незначительном влиянии PARP2 на воспалительный ответ. У мышей генотипа Рагр2‘л наблюдалось лишь незначительное влияние на воспалительный ответ при остром панкреатите, в то время как у РагрГ/_ мышей происходило выраженное ослабление панкреатита в сравнении с животными дикого типа [51]. Противоречивость данных на данный момент не позволяет точно определить роль PARP2 в воспалительном ответе.
Хорошо известно, что гиперактивация PARP1 в ответ на окислительный стресс и многочисленные повреждения ДНК, приводит к гибели нейронов [12, 47]. Ингибирование