Анализ дифференцировки in vitro сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс на разных стадиях онтогенеза

• Автор: Балан, Ольга Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.30, 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Сателлитные клетки как тканеспецифические

стволовые клетки взрослого организма

1.1.1. Идентификация сателлитных клеток и.

их концентрация в мышцах

1.1.2. Формирование пула сателлитных клеток.

1.1.3. Роль генов семейства Рах.

1.1.4. Альтернативные гипотезы происхождения

мышечных сателлитных клеток в эмбриогенезе

1.2. Дифференцировка сателлитных клеток.

1.2.1. Активация и асимметричное деление сателлитных клеток.
Роль белкового фактора .
1.2.2. Роль факторов роста в процессе активации,
пролиферации и дифференцировки сателлитных клеток.
1.2.3. Слияние миобластов и формирование многоядерных миотуб.
Роль генов семейства в регуляции миогенсза.
1.2.4. Экспрессия мышечных генов и синтез структурных
белков мышц в ходе миогенеза
1.2. Сходство и различия миогенеза в эмбриональном развитии и
при активации сателлитных клеток
1.4. Роль Са в процессе дифференцировки
сателлитных клеток и миобластов.
1.5. Использование клеточных культур для изучения процессов миогенсза i vi
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Объект исследования
2.2. Получение и культивирование клеток.
2.3. Гистологическое окрашивание
2.4. Приготовление криостатных срезов.
2.5. Иммуноцигохимический анализ
2.6. Выделение тотальной РНК
2.7. Определение концентрации тотРНК в пробе
2.8. Выделение мРНК.
2.8 Синтез кДНК.
2.9. Конструирование праймеров
2 Нормировка кДНК библиотек.
2 Полимеразная ценная реакция.
2 Выделение ДНК из агарозного геля
2 Секвенироваиие
2 Подсчет количества сателлитных клеток и
миобластов. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Поведение миогенных клетокпрсдшественииков
в культуре
3.2. Иммуиоцитохимическая характеристика культур миогенных клетокпредшествеиников,
выделенных из мышц крыс на разных стадиях онтогенеза
3.3. Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров.
миогенных клетокпредшественников.
3.3.1. Исследование экспрессии гена Рах
3.3.2. Иммуноцигохимический анализ экспрессии.
десмина и мкадгерина.
3.4. Влияние Са на дифференцировку сателлитных клеток и
одноядерных миобластов i vi
3.5. Темпы дифферентфовки миогенных
клетокпредшественпков i vi
3.5. Сравнительный анализ экспрессии генов маркеров
миогенных клетокпредшествеыников в ходе дифференцировки.
3.5.1. Исследование экспрессии гспаРах7 в процессе
дифференцировки сателлитных клеток i vi
3.5.2. Анализ экспрессия гена в процессе
дифференцировки сателлитных клеток и миобластов
3.5.3 Анализ экспрессии гена, кодирующего мкадгерин, в ходе дифференцировки миогенных клетокпредшественников.
3.6. Исследование экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки
сателлитных клеток и миобластов i vi.
3.6.1. Иммуноцитохимпческнй анализ экспрессии
медленной и быстрых изоформ ТЦМ
3.6.2. Анализ экспрессии эмбриональной изоформы ТЦМ
3.6.3. Экспрессия перинатальной изоформы ТЦМ .
3.8.3. Анализ экспрессии изоформьт 3 ГЦМ
3.8.4. Исследование экспрессии гена, кодирующего ТЦМ 2а
Глава 4. Обсуждение результатов
4.1. Сравнительная характеристика культур миогенных клетокпредшественников,
выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза
4.1.1. Адгезивные свойства миогенных клетокпредшественников
4.1.1. Экспрессия генов маркеров
миогенных клетокпредшественников
4.2. Влияние Са на дифферент фовку сателлитных клеток и одноядерных миобластов i vi.
4.3. Темпы дифференцировки сателлитных клеток и миобластов, выделенных из скелетных мышц крыс
на разных стадиях онтогенеза
4.5. Особенности экспрессии различных изоформ тяжелых цепей миозина в процессе дифференцировки
миогенных клетокиредшественников i vi
Выводы.
Список литературы


Однако большинство авторов придерживается общепризнанной точки зрения, согласно которой процессы роста и регенерации скелетных мышц обеспечиваются за счет популяции сателлитных клеток i . Сателлитные клетки мышечной системы являются перспективной моделью для изучения клеточных и молекулярногенетических механизмов пролиферации, диффереицировки, апоптоза и других процессов, протекающих в ходе развития мышц. Исследования, которые проводятся в области биологии сателлитных клеток, направлены на изучение формирования их пула в период развития мышечной ткани в эмбриогенезе , ii, . Поскольку сателлитные клетки образуются в эмбриогенезе в период формирования мышечной ткани и функционируют на протяжении всего онтогенеза, важно выяснить, существуют ли различия между сателлитными клетками, выделенными из мышц в эмбриональный и постнатальный периоды развития. Существенным является вопрос о том, способны ли сателлитные клетки к самоподдержанию в культуре, полученной из мышц животных на разных этапах индивидуального развития. Терминальный этан дифференцировки сателлитных клеток i vi, как и i viv синтез белков сократительного аппарата, прежде всего миозина. Несмотря на многочисленные исследования генов различных изоформ миозина i viv, в литературе отсутствуют данные о специфичности экспрессии этих генов в ходе дифференцировки i vi миогенных клетокi редшественнпков, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза. Поль настоящей диссертационной работы сравнительное исследование процесса дифференцировки i vi сателлитных клеток и миобластов, выделенных из мышц крыс на разных этапах онтогенеза. Проанализировать экспрессию различных изоформ тяжелых цепей миозина эмбриональную, перинатальную, р и 2а при дифференцировке сатсллитных клеток и миобластов, выделенных из мышц животных на разных этапах онтогенеза. Глава 1. Сателлитные клетки как тканеспецифические стволовые клетки взрослого организма. Процессы роста, дифференцировки и восстановления скелетной мышечной ткани в норме и при повреждениях в постнатальный период развития происходят за счет миогенных стволовых клеток i, i, i . Исследования, проведенные за последние несколько лет, показали, что в процессах восстановления мышц могут принимать участие не только сателлитные клетки, но и iv , миогенные клетки iii и iv ii . Сао . Было показано, что эти клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, а также высоким потенциалом к самообновлению. При введении в поврежденную мышцу принимают активное участие в процессе регенерации мышечной ткани . Множественная лекарственная устойчивость клеток обеспечивается наличием i i i белков, которые обладают способностью выводить из клеток цитогоксические вещества . При трансплантации в поврежденную мышцу эти клетки способны как к формированию мышечных волокон, так и к образованию сателлигных клеток i . Субпопуляция циркулирующие клетки крови характеризуется экспрессией гематопоэтического маркера АС 3 3. При кокультивировании с миогенными клетками или при трансплантации в поврежденную мышечную ткань, эти клетки способны к миогенной дифференцировке как i vi, гак и i viv . Сателлитные клетки как тканеспецифпчные стволовые клетки СК формируют стабильный самообновляющийся клеточный пул и составляют основу восстановительного потенциала мышц на всех стадиях онтогенеза i. Озернюк, Балан, . Впервые эти клетки были описаны А. Мауро с использованием электронномикроскопических исследований периферической области миофибрилл в большеберцовой мышце лягушки , на основе анализа их морфологии и расположения в зрелых мышечных волокнах. Позднее сателлитные клетки были идентифицированы в мышцах птиц и млекопитающих , , i, . Общеизвестно, что СК различных тканей, помимо экспрессии специфических маркеров, характерных для недифференцированных делящихся клеток, и способности формировать клоны, проявляют мулътипотентность и в определенных условиях дифференцируются например, гематопоэтические СК в различные клеточные линии. Перечисленные критерии СК относятся также и к сателлитным клеткам мышц. Первоначально предполагалось, что сателлитные клетки эго монопотентпые клетки, которые дают начало только миогенным клеткампредшественникам.