Транзиторные нейроны трохофорных животных и их роль в регуляции развития

• Автор: Воронежская, Елена Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.30
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 195 с. : ил.

Для маркировки клеточных ресничек и цитоскслста нейрональных элементов использовались антитела против ацетилированного атубулина Т, моноклональные, произведены в мыши, i, . НТ, поликлональные антитела, выработанные в кролике, ii, i, США, 0. ОА, моноклональные антитела, выработанные в кролике, любезно предоставлены доктором Эккертом М. I, , поликлональные антитела, выработанные в кролике, ii, i, США, i 1. I I, неМКЕамидподобный аминокислотный пептид VVV и аминокислотный пептид VIVI ii i . Бенджамином i, ivi x, i, . М. i ii ivi, iiii, . ТН, моноклональные антитела I, i, , США. Первичные антитела выявляли при помощи вторичных антител против иммуноглобулинов кролика или мыши, меченных одним из следующих флуоресцентных маркеров флуоресцеинизотиоцианат 1, родамин, x , x8, Ix6 все , . Для лазерной конфокальной микроскопии использовали только маркеры А1еха8 и А1еха6. Для точного определения тел нейронов при иммунохимической реакции окрашивали ядра клеток. Для этого использовали флуоресцентные маркеры ДНК иодистый пропидий и I , которые добавляли в буфер для последней перед заключением промывки в концентрации соответственно 5 и 3 мкгмл. Нейроны выявляли на тотальных препаратах зародышей непрямым иммуноцитохимическим методом в модификации, оптимальной для соответствующих эмбрионов. Перед фиксацией личинок расслабляли постепенным добавлением в раствор мкМ . На каждой стадии для каждого антитела изучали не меньше, чем по 0 зародышей каждого вида. В случае постэмбрионапьных стадий выделялись отдельно ЦНС, буккальная масса, пищевод, нога, мантия, губы, щупальца, половые органы. Иммуноцитохимическая реакция проводилась как тотально, так и на мкм серийных срезах тканей, сделанных на замораживающем микротоме. Перед препарированием моллюсков анестезировали инъекцией мкМ . В общем случае личинок фиксировали часов в 4 параформальдегиде в 0. М фосфатном буфере ФБ, 7. ОА фиксация проводилась в смеси глутаральдегид пикриновая кислота ледяная уксусная кислота при комнатной температуре КТ, промывали 3 раза по мин в ФБ, переносили в этанол и хранили при С ii . Для иммунохимии фиксации доводили до КТ, промывали в ФБ 3 х мин и блокировали места нсспсцифичсского связывания инкубацией в растворе, содержащем нормальной козьей сыворотки, 0. БСА, i Х0 ТХ, и 0. ФБ в течение ночи при С. Затем препараты инкубировали в растворе первичных антител против соответствующего вещества. Рабочее разведение составляло для аТ I, ii i, аОА, и 1 а5НТ и 1 1, в блокирующем растворе. М I , 0 мМ I, 0. ТХ0 при 7. Инкубацию проводили в течение трех дней при С. Затем препараты промывали в ФБ 3 х мин, инкубировали в растворе вторичных антител ii I, коныогнрованные с x 8 , , , разведение в ФБТХ в течение ночи при С, промывали в ФБ 3 х мин, помещали в глицерин в ФБ на один час и заключали на предметные стекла в глицерин в ФБ. Для двойного мечения против и серотонина препараты инкубировали последовательно с 1, 3 дня при С, ii x 8 I , ночь при С, а5НТ 1, ночь при С и ii x 6 I , , 5 часов при . После каждой инкубации следовала промывка в ФБ 3 х i. Обратный порядок инкубации в первичных антителах антисеротонин, затем анти приводил к идентичным результатам. Для двойного мечения против или серотонина и ацетилированного тубулина препараты инкубировали в смеси анти или антисеротониновых антител 1 и моноклональных антител против ацетилированного атубулина i i, произведены в мыши, i, Т, разведение в блокирующем растворе в течение трех дней при С, затем в смеси вторичных антител ii x 6 I и i x 8 I , в течение ночи при С. Затем препараты промывали и монтировали, как обычно. Стандартные контроли включали замену антисыворотки на неимунную сыворотку. В контрольных препаратах никакого окрашивания не наблюдалось. Специфичность первичных антител против ОА, , I, , ii i и была ранее показана на ЦНС взрослых гастропол i . Ii . Специфичность антител к серотонину, которые мы использовали, была ранее подтверждена на развивающихся эмбрионах различных гастропод i, V, i , , . Наши контроли дополнительно включали преинкубацию антител против и I в разведении 1 вместе с 1мкгмл синтетического или I, а также преинкубацию антител к серотонину с коньюгатом серотонинБСА.