Демонстрация потенциальной роли инсуляторов в регуляции экспрессии генов у Drosophila melanogaster

• Автор: Максименко, Оксана Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : ил.

Оглавление

Список используемых сокращений

Введение

1. Обзор литературы.

1.1 Особенности регуляции транскрипции у высших эукариот

1.1.1 Регуляторные последовательности.

1.1.2 Структура хроматина

1.1.3 Возможные принципы взаимодействий между регуляторными элементами на больших дистанциях.

Прямое взаимодействие энхансера и промотора

Взаимодействия транскрипционных факторов с энхансером

1.2 Инсуляторы и системы регуляции экспрессии генов

1.2.1 Разнообразие инсуляторов высших эукариот.
1.2.2 Механизмы регуляции активности инсуляторных белков на примере СТСР.
1.2.3 Возможные принципы работы инсуляторов.
Локальные взаимодействия между белками инсулятора и белками энхансера или
других регуляторных элементов.
Структурная роль инсуляторов.
Роль химических модификаций в функционировании инсуляторов.
1.2.4 Реализация активностей инсуляторов
Связи между инсуляцисй и транскрипционными активаторами
Связи между инсуляцией и топологическими доменами
1.3 Роль инсуляторов в регуляции транскрипции
2. Материалы и методы.
2.1. Генетические методы.
2.1 Л. Линии и мутации i
2.1.2. Трансформация эмбрионов i и получение трансгенных линий
2.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов и iii в трансгенных линиях.
2.1.4. Генетические скрещивания
2.2. Биохимические методы
2.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы
2.2.2. Саузернблотанализ.
2.2.3. Метод полимеразной цепной реакции ПЦР.
2.2.4. Молекулярное клонирование.
2.2.5. Трансформация бактериальных клеток плазмидами.
2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса
2.2.7. Измерение активности Ргалактоз и дазы
2.3. Создание трансгенных конструкций
3. Актуальность проводимого исследования 9
4. Цель и задачи исследования.
5. Результаты.
5.1. Анализ структуры и функциональной активности 1А2 инсулятора.
5.1.1. Изучение энхансерблокирующей активности
5.1.2. Изучение барьерной активности.
5.1.3. Роль белков , 4.2 и Еу2 в активности 1Л2 инсулятора. . Белок .
Белок 4.2.
Белок Еу
5.1.4. 1А2 инсулятор способен к функциональным взаимодействиям.
5.2. Демонстрация возможного участия инсуляторов в установлении энханссрпромоторных взаимодействий.
5.2.1. Дизайн тестсистемы для изучения влияния функциональных взаимодействий между разными наборами инсуляторов на экспрессию генов
5.2.2.Сила влияния взаимодействий между инсуляторами на работу генов зависит от взаимного расположения и расстояний между всеми участниками транскрипционной регуляторной системы.
Взаимодействия между тандемно расположенными инсуляторами всегда ли
работает нейтрализация.
Взаимодействия между инсуляторами, окружающими первый маркерный ген что
произойдет при увеличении расстояния между инсуляторами
Взаимодействия между инсуляторами, окружающими оба маркерных гена можно ли смоделировать независимый транскрипционный домен
5.2.3. Значение структуры инсуляторов при модулировании энхансерпромоторных взаимодействий БиНзависимыс инсуляторы не едины в эффектах влияния на уровень экспрессии генов
6. Обсуждение,.
7. Выводы
Список использованной литературы


Исходя из этих предпосылок в данном обзоре будет представлен краткий обзор регуляторных элементов, проведен сравнительный анализ инсуляториых активностей и возможных механизмов работы инсуляторов, а также продемонстрировано, какой вклад инсуляторы могут вносить в энханссрпромоторные взаимодействия. Особенности регуляции транскрипции у высших эукариот. Важную роль в процессе регуляции транскрипции играют транскрипционные факторы. Доступность и набор специфических регуляторных элементов ДНК в совокупности с комбинациями активных транскрипционных факторов обеспечивают специфическую транскрипцию гена в данном типе клеток. Каждый тип клеток, соответственно, характеризуется собственной уникальной комбинацией белковых факторов, появление и динамическое изменение которых в ходе диффереицировки обеспечивает систему эффективной регуляции активности генов. Сам процесс транскрипции запускается после образования сложного белкового комплекса на ДНК. Различные комбинации регуляторных последовательностей узнаются соответствующими специфическими ДНКсвязывающими белками. Так как данная работа посвящена взаимодействиям между регуляторными элементами, вначале необходимо рассмотреть типы регуляторных элементов и возможные модели их функционирования. Регуляторные последовательности. Базальный промотор участок ДНК от до п. В состав базального промотора могут входить ТАТАбокс, IIузнающий элемент , инициатор, внутренний промотор . Для РНКполимеразы II характерно два типа промоторов содержащие ТАТАбокс АТбогатый участок, расположенный на расстоянии около п. Ру2САР5. Существуют так же промоторы, не содержащие ни ТА ГА, ни . Существенный вклад в регуляцию транскрипции вносят энхансеры сайты связывания белковактиваторов транскрипции i . Энхансеры способны специфически влиять на транскрипцию гена, находясь как вблизи промотора от до нескольких сотен пар оснований перед точкой инициации, так и на очень больших расстояниях иногда равных нескольким десяткам тысяч пар нуклеотидов от промотора, часто в любой ориентации по отношению к нему , . Для белков, взаимодействующих с энхансерами, характерно наличие двух доменов ДНКсвязывающего и трансактивирующего ответственен за белокбелковые взаимодействия с компонентами комплекса, осуществляющего транскрипцию , , . Согласно наиболее распространенной модели, ДНК между энхаисером и промотором образует петлю, в результате чего белковый фактор, связанный с энхаисером, приобретает способность модулировать экспрессию соответствующего гена, непосредственно взаимодействуя с одним из общих факторов транскрипции или РНКполимеразой. Экспрессия некоторых генов может контролироваться несколькими энхансерами. Особенно это характерно для генов, контролирующих сегментацию и развитие осевых структур. Например, экспрессия генов vi пять различных энхансеров, два из которых находятся с 5стороны от промотора, три с У vi, i, , 4 энхансера с 3 стороны от гена i vi, , vi . Часть энхансеров обладает специфичностью по отношению к промотору активируемого гена. Учитывая способность энхансеров действовать на значительных расстояниях, очевидно существование механизмов, обеспечивающих такую специфичность действия энхансеров. В определенном генетическом контексте и в определенном типе клеток энхансер должен обладать наибольшим сродством лишь к одному из близко расположенных промоторов. Данное явление получило название конкуренция промоторов. Например, экспрессия морфогена определяется наличием у гена одного энхансера и нескольких промоторов, которые активны на разных этапах раннего развития эмбриона и специфичны по отношению к концентрации других морфогенов. В рглобиновом локусе курицы единственный энхансер связывается с промотором одного из нескольких генов на определенных стадиях развития организма vi i, , . В обеспечении необходимой специфичности действия энхансеров задействованы различные механизмы. Часто энхансеры имеют сродство к определенному типу промоторов ТАТА или содержащему. Хорошо изученным примером являются энхансеры и АЕ1, избирательно активирующие гены i и i , соотвественно. Показано, что их специфичность обусловлена наличием у активируемого промотора канонической ТАТАпослсдовательности. В отсутствие поблизости ТАТАсодсржащего промотора данные энхансеры могут активировать содержащий ген.