Причины и механизмы поддержания высокого уровня транскрипционного фактора NF-kB в линиях аденокарцином мыши

• Автор: Смирнов, Анатолий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Место защиты: Б. м.
• Количество страниц: 100 с. : ил

Введение.

1. Обзор литературы

1.1 Структура транскрипционного фактора ОТкВ и ею субдъединиц

1.1.1 Полипептиды р и р

1.1.2 Полипептиды р ЯеА, р Кс1В и сге

1.2 Последовательности ДНК, связывающие Небелки комплексы

1.3 Ингибиторы тРкВ семейство 1кВ белков

1.4 Механизмы деградации 1кВ.

1.5 кВ и коактиваторы транскрипции

1.6 Роль кВ в блокировке и активации апоптоза.

1.7 МРкВ и окислительный стресс

1.8 кВ и рак.
1.9 Клетки с высоким конституитивным уровнем ядерного ОТкВ.
1. Опухолевый супрессор р.
Регуляция р
р и арест клеточного цикла.
р и индукция апоптоза
1. Заключение.
2. Материалы и методы.
2.1. Клеточные липни и трансфекции.
2.2. Плазмиды
2.3. Измерение САТактивности
2.4. Анализ апоптоза.
2.5. Выделение ядерных белковых экстрактов.
2.6. Анализ ядерных белковых экстрактов с помощью экспериментов но торможению ДНКбелковых комплексов в геле
2.7. Иммуноблот со специфичными антителами
2.8. Иммунопреципитация и разделение белков в
денатурирующем ПААГ.
2.9. Реактивы
3. Результаты и их обсуждение.
3.1. Клетки I0 и I0 обладают высоким конститутивным уровнем транскрипционного фактора кВ
3.2. ТРСК и уменьшают уровень активного кВ в
клетках КСМЛ0 и КСМЛ0.
3.3. ТРСК и вызывают апоптоз в клетках
КСМЛ0 и КСМЛ0.
3.4. Низкие дозы ТРСК делают клетки КСМЛ
чувствительными к ФНО.
3.5. Трансфекция клеток КСМЛ0 вектором,
экспрессирующим IкВа сунеррепрессор приводит к их гибели.
3.6. Микроинъекция вектора, экспрессирующею сунерреирессор
1кВа в клетки КСМЛ0 приводила к фрагментации ядер.
3.7. Понижение уровня активного кВ с помощью ТРСК и 1кВа не влияет на уровень стус, но вызывает резкое падение
уровня р в клетках КСМЛ0.
3.8. р функционально активен в клетках КСМЛ0.
3.9. Для выживания клеток КСМЛ 0 необходим высокий
уровень белка р, а не его трансактивационная активность.
3. Белок 1кВа стабилен в клетках КСМЛ0 и короткоживущ в клетках КСМЛ
3 Доминантнонегативный ТЯАР2 подавляет активность
РЕкВ в клетках КСМЛ0, но не в клетках КСМЛ0.
3 ОТкВ комплексы не связаны с 1кВа в клетках КСМЛ0.
3 ТРСК индуцирует в клетках КСМЛ0 неизвестный полипептид с молекулярной массой около кДа р, который
связывается с кВ
4. Список литературы
Используемые сокращения
Среда среда Игла, модифицированная Дульбреко
дитиотрейтол
фенилметилсульфонилфлнюрид
додецилсульфат натрия
ПААГ полиакриламидный гель
фосфатный солевой буфер
ПЦР полимеразная цепная реакция
п.н. пар нуклеотидов
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
БСАбычий сывороточный альбумин
хлорамфениколацстилтрансфераза
Трисгидроксиметил метиламин
1Ч2гидроксизтилпипсразин1У2зтасульфоновая кислота кДа килодалы он
этилендиаминтетрауксусная кислота
этилсндиокси диэтилендинитрилотетрауксусная кислота ТРСК ЧтозилЬфенилаланин хлорметил кетон.
пирролндин дитиокарбамаг.
ФНО фактор некроза опухоли а.
онитрофенил галактопиранозид.
X 5бромо4хлоро3индолнл галактопиранозид.
За ргалактозидаза.
Ключевые слова
ЪтРкВ, р, аденокарцинома, апоптоз, регуляция гранскрипции.
Введение


Оглавление. Ключевые слова. Введение. Механизмы деградации 1кВ. Роль кВ в блокировке и активации апоптоза. В и рак. Клетки с высоким конституитивным уровнем ядерного ОТкВ. Опухолевый супрессор р. Заключение. Материалы и методы. Клеточные липни и трансфекции. Анализ апоптоза. Выделение ядерных белковых экстрактов. ПААГ. Результаты и их обсуждение. КСМЛ0 и КСМЛ0. КСМЛ0 и КСМЛ0. ФНО. IкВа сунеррепрессор приводит к их гибели. Ва в клетки КСМЛ0 приводила к фрагментации ядер. КСМЛ0. КСМЛ0. РЕкВ в клетках КСМЛ0, но не в клетках КСМЛ0. ОТкВ комплексы не связаны с 1кВа в клетках КСМЛ0. ТРСК ЧтозилЬфенилаланин хлорметил кетон. ФНО фактор некроза опухоли а. X 5бромо4хлоро3индолнл галактопиранозид. За ргалактозидаза. ЪтРкВ, р, аденокарцинома, апоптоз, регуляция гранскрипции. Введение. Целью настоящей работы является изучение причин и механизмов поддержания высокое конституитивного уровня транскрипционного фактора ЫРкВ в ядрах клеток адснокарцином мыши КСМЛ0 и КСМЛ0. Также в данной работе затрагиваются вопросы взаимосвязи ЫРкВ и опухолевого супрессора р. В является одним из наиболее изученных транскрипционных регуляторов. Его активность может быть индуцирована широким спектром сигналов, от бактериальных и вирусных патогенов до цитокинов, цитотоксичсских агентов и ультрофиолетового излучения. Транскрипционные мишени ЫРкВ также весьма разнообразны и вовлечены в регуляцию множества биологических процессов, таких как имунный ответ, трансформация, пролиферация или программируемая клеточная смерть апоптоз. В связи с этим особенный интерес вызывают ткани и клеточные линии, имеющие повышений базальный уровень ядерного ЫРкВ. Несмотря на то, что регулялция активации ЫРкВ в ответ на индуцирующий сигнал интенсивно исследуется в последние годы и ее общие закономерности достаточно изучены, механизм поддержания высокого конституитивного уровня яденого ЫРкВ в тех тканях и типах клеток, в которых он высок еще слабо изучено. Именно этим двум вопросам и посвящена насиоящая работа. Структура транскрипционного фактора кВ и его субдъединиц. Транскрипционный фактор кВ В ядерный фактор каппа Б был впервые описан как белок, специфически связывающийся с последовательностью ДНК 5, 6. Эта последовательность была определена как присущий Влимфоцитам элемент положительного регулятора гена легкой цепи к иммуноглобулинов 7. В дальнейшем было показано, что в большинстве типах клеток кВ может быть индуцирован в ядре воздействием одного из индукторов фактора некроза опухолей, РМА форболовых эфиров, липополисахаридов и многих других. Было также показано, что воздействие детергентами на цитоплазматические фракции приводит к акгивации кВ в бесклеточной системе 8. Кроме того, активация кВ i viv не зависит от синтеза белка v 5. На основании этих данных была выдвинута гипотеза о том, что активация кВ идет путем не зависящей от транскрипции мобилизации в ядро неактивной цитоплазматической формы 5. Согласно современным взглядам, кВ является убиквитинзависимым транскрипционным фактором, который, за исключением некоторых типов клеток, активируется под действием сфессовых сигналов, после чего попадает в ядро в форме, способной связывать ДНК. При выделении кВ на афинной колонке из клеточных линий человека 9, и кролика были получены два полипептида с молекулярной массой и кДа, названных, соответственно, р и р А.