Выяснение роли Su(Hw)-инсулятора в стимуляции транскрипции и идентификация новых регуляторных элементов Bithorax-комплекса Drosophila melanogaster

• Автор: Мельник, Елена Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Регуляторные элементы эукариот

2.2. Свойства и разнообразие инсуляторов.

2.2.1. Инсуляторы в локусе гена теплового шока

2.2.2. Инсуляторные свойства промотора v

2.2.3. Инсулятор в локусе гена

2.2.4. Инсуляторный элемент внутри ретротранспозона Iix

2.3. Свойства 8иНуинсулятора

2.4. Пространственная и функциональная организация ixкомплскса

3. Материалы и методы
3.1. Генетические методы
3.1.1. Линии и мутации i , использованные
в данной работе
3.1.2. Трансформация эмбрионов i и получение трансгенных линий
3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов и i
в трансгенных линиях.
3.1.4. Генетические скрещивания.
3.2. Биохимические методы.
3.2.1. Выделение ДНК из дрозофилы.
3.2.2. Саузернблот анализ
3.2.3. Метод полимеразной цепной реакции ПЦР
3.2.4. Секвенирование плазмид и ГЦР продуктов
3.2.5. Молекулярное клонирование
3.2.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами
3.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса
3.2.8. Выделение фрагментов ДНК из геля .
3.2.9. Создание конструкций
4. Результаты.
4. 1. Исследование новых свойств инсулятора .
4.1.1. стимулирует транскрипцию гена ,
если удалена регуляторная область перед промотором
4.1.2. Уровень стимуляции транскрипции напрямую зависит
от числа сайтов связывания белка .
4.1.3. Предполагаемые участки прикрепления к ядерному матриксу
в инсуляторс не участвуют в стимуляции гена .
4.1.4. Инсулятор не обладает способностью
компенсировать отсутствие анхансера
4.1.5. Функциональный анализ доменов белка
4.1.6. Анализ влияния инсулятора на экспрессию гена i.
4. 2. Новые регуляторные элементы ixкоштехса
4.2.1. Регуляторная область гена взаимодействует с МСР
при активации гена i энхансером глаз
4.2.2. Регуляторная область гена содержит сайленсер
4.2.3. Фрагмент из домена i не репрессирует транскрипцию
гена и не взаимодействует с МСР
4.2.4. Фрагмент из домена i4 проявляет свойства инсулятора.
5. Обсуждение результатов.
5.1. Новые свойства
5.1.1. является стимулятором работы промотора,
действующим на больших расстояниях
5.1.2. Функции блокирования энхансера, репрессии и
активации обеспечиваются различными доменами белка .
5.1.3. Возможные механизмы стимуляции транскрипции
инсулятором 8иНш
5.2. Новые данные о В7юткомплексе
5.2.1. Исследованные фрагменты ВНИогахкомплекса проявляют
свойства регуляторных элементов.
5.2.2. Модель функциональной организации ВИИогахкомплекса.
Выводы.
Список использованной литературы


Данные исследований показывают, что он может репрессировать промотор гена i на эмбриональной стадии и промотор гена . Помимо этого может быть и активатором транскрипции. и . До сих пор не существует единого мнения о механизмах, лежащих в основе действия инсуляторов. Изучение новых свойств поможет установить характер взаимодействий между различными элементами, участвующими в регуляциии экспрессии. Задачей этой работы являлось исследование влияния, оказываемое 8иНуинсулятором на работу промоторов генов и i, и определение функциональных элементов инсулятора и белка , необходимых для стимуляции промотора. Другая часть нашей работы была посвящена изучению одной из интереснейших регуляторных систем, которой является 2 Аогахкомплекс i . Гомеозисные гены, входящие в состав этого комплекса, определяют развитие и приобретение индивидуальных черт сегментов тела дрозофилы. Инфраабдоменальные участки регуляторной последовательности комплекса представляют собой серию изолированных хроматиновых доменов, которые содержат по одному энхансеру, активирующему экспрессию одного из генов. В каждом парасегменте промотор гомеозисного гена активируется энхансером, расположенным в соответствующем домене. Обособленность такого функционального взаимодействия обеспечивается регуляторными модулями, расположенными на границах доменов. К настоящему моменту описаны только три таких модуля 8, 7 и . Логично предположить существование других регуляторных модулей в составе Л7югахкомплекса, а также то, что в области промоторов гомеозисных генов имеются элементы, взаимодействующие с регуляторными модулями инфраабдомснальных доменов. Мы решили отобрать фрагменты 57Аогахкомплекса, которые по своим структурным характеристикам могли бы являться регуляторными элементами, и изучить их функциональное взаимодействие с МСР и другими элементами модельной генетической системы. Полученные нами данные являются вкладом в изучение функциональных взаимодействий между различными регуляторными элементами 7Аогшкомплекса. Результаты проведенной работы также являются полезными для понимании генетических основ процесса развития организма и для генной терапии, в которой инсуляторы, обеспечивающие специфичную активацию и независимую экспрессию трансгенов, находят все большее применение. Регуляторные элементы эукариот. Геномы эукариот содержат тысячи генов, уникальный паттерн экспрессии которых определяет специфичность свойств клеток организма. Транскрипционная активность генов является одной из характеристик хроматиновой организации генома. Гетерохроматин обуславливает репрессию транскрипции эухроматиновых генов, помещенных в такие области. В то же время перемещение генов, в норме расположенных в гетерохроматиновых областях, в эухроматин приводит к потере экспрессии. Такой эффект положения подразумевает, что для соответствующего паттерна экспрессии генов необходимы правильная организация и поддержание независимых хроматиновых доменов ,5. Специфичные транскрипционные факторы могут изменять структуру хроматина посредством взаимодействия с регуляторными элементами. Исследования последних десятилетий позволили приблизиться к разгадке механизмов функционирования этих элементов энхансеров, сайленсеров и инсуляторов. Регуляция на небольших расстояниях обеспечивается промотором, включающим коровый элемент, на котором образуется транскрипционный комплекс, и близлежащих областей, с которыми связываются белкиактиваторы. Действие энхансеров и сайленсеров противоположно по своему эффекту, эти элементы способны контролировать экспрессию на больших расстояниях и независимо от ориентации по отношению к промотору гена. Энхансеры и сайлснссры демонстрируют ограниченную специфичность к промотору, это предполагает, что их влияние может распространяться и на не свойственные им гены , . Инсуляторы препятствуют взаимодействиям между регуляторными элементами генома эукариот. Эти элементы ограничивают функции энхансеров и сайленсеров и обеспечивают регуляцию генов внутри гетерохроматиновых и эухроматиновых доменов.