Определение функциональной значимости взаимодействия катенина р120 с метил-ДНК связывающим белком Каизо

• Автор: Айтхожина, Дана Сабировна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

Введение.

1. Обзор литературы

1.1 Белки семейства

1.2. Белок Каизо и его особенности

1.3 ДНК связывающий домен цинковые пальцы

1.4 р0 катеннн и его особенности.

1.5 Белки и I семейств роль и регуляция

1.6 Регуляция ядериого транспорта , и их регуляция.

1.7 Дрожжевая другибрндная система

2. Материалы и методы.

2.1 Методики

2.2 Полимеразная цепная реакция.
2.3 Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.4 Бактериальные штаммы и плазмиды.
2.5 Конструкции.
2.5.1 Конструкции, использованные в экспериментах по определению клеточной локализации Каизо.
2.5.2 Конструкции для поиска сигнала ядерион локализации
2.5.3 Конструкции для дрожжевой двугибридиой системы
2.5.4 Конструкции, использованные в экспериментах по иммунонреципитации. .
2.5.5 Получение конструкций, кодирующих функциональные домены Каизо с концевым и С концевым НА пептидами.
2.5.6. Получение конструкций для эксперимента i vi фосфоршшровалшо Каизо
2.6 Работа с дрожжами
2.6.1 Культивирование дрожжей
2.6.2 Получение дрожжевых компетентных клеток
2.6.3 Трансформация дрожжевых компетентных клеток
2.6.4 Маттинг
2.7 Выделение ядерных белковых экстрактов
2.8 Гель фильтрационная хроматография.
2.9 Вестерн блот гибридизация со специфическими антителами
2. Иммунонреципитация и разделение белков в денатурирующем ПААГ. .
2. Клеточные линии и трансфекции.
2. Иммунофлуоресцентный анализ.
2. Экспрессия рекомбинантных белков
2. Эксперимент но задержке ДНК белковых комплексов в геле
2. Анализ статуса фосфорилнрования белка Каизо.
Дсфосфорилирование с помощью X фосфатазы.
Мечснне белков Р i viv
Получение пептидов при помощи обработки трипсином.
Картирование фосфорилированных пептидов.
Анализ фосфорилнрования аминокислот.
Анализ статуса фосфорнлировання функциональных доменов белка
. I vi фосфорилирование Каизо
2. Метилирование ДНК с помощью I мстилазы.
2. Тест на способность Каизо функционировать как метил зависимый репрессор
2. Тест на способность Каизо функционировать как метил зависимый активатор
3. Результаты н их обсуждение.
3.1 Каизо и р0 находятся в разных белковых комплексах в ядерных экстрактах клеток эритролейкемии человека К2.
3.2 Каизо подвергается пост трансляционной модификации.
Каизо фосфорилнровап по остаткам сернна
3.4 Каизо содержит 2 или 3 сайта фосфорилирования.
3.5 Каизо фосфорилнровап по остаткам серина, расположенным в домене.
3.6 МарКарКЗ киназа не фосфорилирует Каизо i vi.
3.7 Фосфорилированис белка Каизо по остаткам серина, расположенным в домене не препятствует связыванию Каизо с р0.
3.8 В дифференцированных клетках линии РС Каизо распределен по всей клетке .
3.9 Клеточная локализация Каизо регулируется ингибитором I.
3. Характеристика сигнала ядерной локализации Каизо.
3. Анализ взаимодействия Каизо с р0 в дрожжевой двугибридной системе.
3. р0 способен маскировать сигнал ядерной локализации белка Каизо.
3. Влияние р0 на функциональную активность белка Каизо
3. Уровень н клеточная локализация катенина р0 не изменены при генетическом нокауте Каизо.
4. Выводы
5. Список литературы.
Используемые сокращения
среда Дульбекко, модифицированная Иглом смесь дезоксирибонулеотид трифосфатов ОТТ дитиотрейтол
фенилметилсульфонилфлюорид додецил сульфат натрия ПЛАТ полиакриламидный гель фосфатный солевой буфер ПЦР полимеразная цепная реакция i гидроксиметил метиламин
Ы2п1дроксиэтилпиперазинЫ2этансульфоновая кислота
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭГТА этилендиоксидиэтилендинитрилотетрауксусная кислота
ИПТГ изопропилтноРгалактозид
кДа кило Дальтон
пара ЦфГ динуклеотид
Введение


Нарушение функционирования этой системы, связанное с дефектами каких либо компонентов связывают с метастатическим фенотипом в случаев карцином человека. Ключевая роль катенина i заключается в его способности постгрансляционно стабилизировать Е кадхерии и влиять на силу адгезии клеток, а также регулировать динамику цнтоскелета. Каизо, новый член семейства домен содержащих транскрипционных факторов, был впервые охарактеризован как партнер i в дрожжевой двугибридной системе. У позвоночных, большинство белков I1, I6, , 5, являются регуляторами транскрипции и ассоциируются либо с ростом, либо подавлением роста опухолей. Лучше всего это показано на примере Вс белка, прямо ответственного за возникновение лимфом В клеток. Вс является транскрипционным репрессором различных генов, включая циклины 1 и 2. Как было показано мыши, с генетически удаленным геном Каизо приобретают устойчивость к возникновению рака кишечника. Исходя из выше сказанного, возрастает важность изучения взаимодействия Каизо и катенина р0, особенно если предположить существование некоторого сигнального пути, ответственного за передачу сигналов с поверхности клетки в ядро, приводящего к выключению некоторых метилированных генов. Предположительно, не только Каизо с р0, но и Екадхерин могут являться компонентами такого сигнального каскада. Таким образом, становиться понятно, что изучение подобного взаимодействия способно внести существенный вклад в понимание процессов как опухолеобразовання, так и функционирования нормальной соматической эмбриональной клетки при транслировании эпигенетической информации. Белки семейства. Метилирование по остаткам цитозина достаточно распространенный процесс эта модификация обнаружена в геноме многих беспозвоночных, например у плодовой мушки i . Однако наиболее изучаемыми с точки зрения метилирования ДНК являются геномы позвоночных, имеющие гораздо более высокий уровень метилирования по сравнению с беспозвоночными ведь около всех динуклеотндов в их геноме метилировано. Исключением являются так называемые островки последовательности, характерными особенностями которых являются высокое процентное содержание относительно среднего содержания по геному, а также отсутствие метилирования. Принято считать, что подобные области маркируют активные области генома, и поэтому в нормальных тканях не метилируются2. Метилирование динуклеотидов в ДНК млекопитающих вовлечено в раннее эмбриональное развитие, и необходимо для множества биологических процессов, например для X инактивации3и импринтинга4. Многие из этих процессов обусловлены влиянием метилирования на транскрипцию. ДНК. Семейство этих ii белков характеризуется наличием в первичной последовательности так называемого домена, длиной около аминокислотных остатков, ответсвенного за связывание с метилированной ДНК 6, и состоит из следующих членов 1, 2, 3, 4 и МсСР2. Белок 1 содержит в своем составе несколько функциональных доменов, помимо домена, а именно три домена СххС и ii i i домен. Эти домены вовлечены в репрессию транскрипции 7, и кроме того обеспечивают связывание 1 с другими белковыми факторами. Например, за счет домена происходит взаимодействие 1 с так называемым 1ii i i 8. С другой стороны, посредством домена происходит взаимодействие с комплексами vII9 и . Белки 2 и 3 имеют схожую интрон экзонную структуру, а также очень высокую степень гомологии первичной структуры около п. При этом их функции весьма различны 3 является структурной субъеденицей i i x комплекса 2, 2 является одной из ДНК связывающих субъсдениц комплекса МеСР . Генетический нокаут этих белков в мышах также приводит к совершенно различным послдсгвиям в случае 3 смерть эмбриона на самых ранних стадиях, а в случае 2 единственным эффектом является ненормальное поведение в процессе матисринства ,4. Белок 4 отличается от остальных белков семейства он является частью системы репарации и содержит в своем составе глнкозилазный домен. Этот белок вовлечен в процесс узнавании и репарации спотанного дезаминирования метилированных остатков цитозина . При генетическом нокауте этого гена наблюдается накопление этих мутаций, ведущее к увеличению частоты возникновения раковых заболеваний 6.