Молекулярно-генетические характеристики рибосомных генов и процессы гибели клеток у больных ревматоидным артритом

• Автор: Шубаева, Наталья Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Структурно функциональная организация рибосомных повторов человека млекопитающих.

1. Структура рибосомных повторов человека

2. Число копий рибосомных повторов в геноме человека

2.1. Определение содержания рДНК в геноме человека.

2.2. Изменение числа копий рДНК при патологии и при старении

3. Метилирование рибосомных повторов.

3.1. Метилирование рибосомных повторов человека и млекопитающих.

3.2. Влияние метилирования на транскрипцию РГ. Изменение метилирования рДНК при патологии и старении.

4. Активные копии рибосомных генов в геноме человека.

Аокраска ЯОР хромосом.

5. Генные болезни, связанные с нарушением транскрипции и процессинга рРНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Пациенты
2. Определение биохимических и иммунологических показателей
3. Определение общего числа копии РГ в геномной ДНК человека.
3.1 Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови
3.2. Определение концентрации ДНК.
3.3. Нерадиоактивная дотгибридизация образцов ДНК с зондом
на рДНК
3.4. Определение гибридизацнонного сигнала
3.5. Построение калибровочных зависимостей для зонда.
3.6. Определение количественного показателя метилирования.
3.7. Стандартная ошибка метода
4. Исследование ответа культивируемых фибробластов на окислительный стресс.
4.1. Культуры клеток.
4.2. Схема эксперимента
4.3. Определение общего количества РНК и ДНК.
4.4. Определение количества рРНК в образцах нуклеиновых
кислот, выделенных из клеток
4.5.0пределение ферментативной активности каспазы
5. Выделение и анализ фрагментов ДНК сыворотки больных РА и среды
культивирования фибробластов кожи
6. Определение относительного количества активных РГ АкРГ
7. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Характеристика комплекса рибосомных генов больных ревматоидным артритом.
1.1. Общее число копий РГ в геномах больных РА.
1.2. Относительные количества активных копий РГ в
геномах больных РА.
1.3. Кластеры молчащих рибосомных генов в геномах больных РА
1.4. Уровень метилирования транскрибируемой области РГ больных РА.
1.5. Количество продукта транскрипции РГ в лимфоцитах больных РА.
1.5.1. Сопоставление относительного количества АкРГ а и количества РНК рРНК в неделящихся клетках.
1.5.2. Уровень РНК рРНК в лимфоцитах больных РА
2. Разработка количественного метода оценки уровня апоптоза клеток
организма
2.1. Определение концентрации и размера фрагментов ДНК в сыворотке крови больных РА.
2.2. Изменение концентрации ДНК сыворотки в процессе лечения
2.3. Определение фрагмента гена рРНК в сыворотке крови больных РА.
3. Характеристики комплекса РГ больных РА и количественные показатели гибели клеток организма
4. Ответ культивируемых фибробластов кожи здоровых доноров и больных РА на окислительный стресс. Взаимосвязь скорости гибели клеток и количества активных копий РГ в геноме
4.1. Ответ культивируемых фибробластов кожи здоровых доноров на окислительный стресс.
4.2. Количество активных рибосомные генов в геноме и интенсивность гибели клеток при действии хромата калия
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
3 внешний транскрибируемый спейсер основания
5 внешний транскрибируемый спейсер основания
АЯОР ЯОР хромосом, окрашивающиеся азотнокислым серебром
I 3i ii i
бычий сывороточный альбумин
I1 внутренний транскрибируемый спейсер
I2 внутренний транскрибируемый спейсер
нитротетразол и й голубой i i i,
I нстранскрибирусмый мсжгенный спейсер додецилсульфат натрия
i стандартный солевой раствор
аминокислота АкРГ активные рибосомные гены АНФ антинуклеарный фактор АФК активные формы кислорода АХ акроцентрические хромосомы БШ больные шизофренией ДМФА диметилформамид ЗД здоровые доноры ИЛ интерлейкин
КМРГ кластеры молчащих т.е. неактивных генов мяРНП малый рибонуклсопротсид ядрышка НК нуклеиновая кислота ОР однонитевой разрыв
ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных ферментов
ПКГ профаммированная клеточная гибель
ПСБ прочно связанные с рДНК белки
РА ревматоидный артрит
РГ рибосомные гены
РеА реактивный артрит
РО рибосомный оперон
РП рибосомный повтор
РФ ревматоидный фактор
СКВ системная красная волчанка
СРБ Среактивный белок
ТО транскрибируемая область
ФГА фитогемагглютинин
ФНО фактор некроза опухоли
ФЦ фибриллярные центры
ХК хромат калия
ЭДТА этилендиаминтефауксусная кислота ЯОР ядрышкообразующие районы хромосом
ВВЕДЕНИЕ


Рибосомы эукариот, находящиеся в цитозоле, состоят из малых 5 и больших 5 субчастиц. Малые субчастицы содержат 1 молекулу РНК 5 размером нуклеотидов и белков большие 3 цепи РНК длиной 0 5Б, 0 5, и 5 нуклеотидов и белков. Гены трех рибосомиых РНК 5, 5 и 5, организованы у большинства организмов в виде тандемно повторяющихся последовательностей, при этом транскрибируемые области чередуются с нетранскрибируемыми участками спейсерами. Иногда в состав повторяющейся единицы входит ген рРНК. Однако, в геномах большинства эукариотических организмов в том числе и у человека кластеры генов рРНК и трех рРНК располагаются в разных, не связанных между собой участках генома. РНК в результате работы фермента РНКполимеразы I. Одна копия рибосомного повтора человека РП содержит 8 пар оснований. Первичная последовательность РП человека полностью определена в году см. I Vi, 9, i i i. В структуре РП выделяют транскрибируемую область длина 9 и нетранскрибируемый межгенный спенсер . Кодирующие области генов , 5,8 эукариот сгруппированы в указанном порядке в одну транскрипционную единицу. Все три РЖ образуются из длинного транскрипта предшественника в результате процессинга, включающего расщепление РК эндонуклеазами, введение псевдоуридина и метилирование. Транскрибируемая область полная транскрипционная единица содержит два иекодирующих спейсера называемых внутренними транскрибируемыми спенсерами, I, которые разделяют три кодирующие области, а также имеет некодирующие участки перед первым геном и за последним геном эти участки называются внешними транскрибируемыми спенсерами, см. При процессинге рибосомной РЖ транскрибируемые спейссры удаляются . В целом внутри рибосомного повтора человека и большинства эукариот наблюдается чередование консервативных и вариабельных участков. Замечено, что консервативные последовательности в рДНК соответствуют двухспиральным структурам РЖ в составе рибосом,
Рис. Транскрипционная единица РП человека цитируется по работе . Показаны вариабельные районы рДНК VI Vi. I1 внутренний транскрибируемый спейсер I2 внутренний транскрибируемый спейсер нстранскрибируемый межгенный спейсер основания . РНК. В процессе эволюции наблюдается увеличение длины генов и рРНК и транскрибируемых спейсеров, однако общие принципы структурной организации повтора остаются неизменными. Особенно сильно варьирует размер гена большой субъединицы рибосом дрожжи п. Эта изменчивость обусловлена наличием вариабельных по длине и последовательности районов, диспергироваными между консервативными основными последовательностями, которые сохраняют общую пространственную структуру кодируемой молекулы рРНК . У человека наблюдаются инсерции и замены нуклеотидов в вариабельных участках рРНК. Наиболее изучен один из самых вариабельных районов V5 порядковые нуклеотиды , рис. Показаны существенные межиндивидуальные различия в последовательности этого района. Однако в пределах одного генома также были выявлены несколько типов последовательностей У5района. Авторами обнаружен интересный феномен количественные пропорции транскриптов различной последовательности одинаковы в разных тканях одного и того же организма. Неодинаковое содержание вариантов рРНК У5района в суммарном образце рРНК авторы объясняют различиями в регуляции транскрипции. Леффер и Андерсен , , исследовали 1 фрагментов У8района рис. Вариации затрагивают в основном два участка, которые разделены 0 нуклеотидами, по пространственно в третичной структуре рРНК сближены. Точечные мутации найдены в консервативных районах гена рРНК. Вариант наличия А или нуклеотида в положении встречается с разной частотой у человека. Замена А на произошла сравнительно недавно и не обнаруживается у других приматов. Авторы сообщают о преимущественной транскрипции с одного из вариантов копии рДНК. В геноме i содержится копий рДНК с Ануклеотидом в положении гена рРНК, при этом продукта этой копии гена в клетке содержится всего 1 от общего количества копий рРНК . Внутривидовая вариабельность транскрибируемых спейсеров человека приблизительно соответствует вариабельности рДНК .