Функциональный анализ полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям на примере гена 5HT2A-R

• Автор: Полесская, Оксана Олеговна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Серотониновая система нейротрансмиссии

1.1. Серотонин и серотонсргичсские нейроны

1.2. Синтез и деградация серотонина

1.3. Рецепторы серотонина

1.4. Функции серотонина в центральной нервной системе

2. Шизофрения как комплексное заболевание

2.1. Классификация и симптомы шизофрении

2.2. Эпидемиология, патофизиология и этиология шизофрении

2.2.1. Эпидемиология заболевания

2.2.2. Патофизиологические изменения
2.2.3. Этиология шизофрении
2.3. Подходы к обнаружению генов, вовлеченных в развитие шизофрении
2.3.1. Геномные сканы
2.3.2. Изучение кандидатных генов
2.3.3. Генные чипы
2.4. Эпигенетические факторы в возникновении шизофрении
2.5. Биохимические нарушения при шизофрении
2.5.1. МАО
2.5.2. Норэпинефрин норадреналин
2.5.3. Ацетилхолин
2.5.4. Глутамат
2.5.5. ГАМК
2.5.6. Дофамин
2.5.7. Серотонин
2.6. Ассоциация полиморфизма Т2С в гене серотонинового рецептора 5НТ2АК с шизофренией
3. Дифференциальная экспрессия аллелей генов, вовлеченных в шизофре и другие психические заболевания
4. Эпигенетическая регуляция транскрипции
4.1. Метилирование ДНК
4.2. Структурная организация ДНК
4.3. Порядок событий при ингибировании транскрипции
4.4. Способы анализа степени метилирования ДНК
4.5. Роль эпигенетической регуляции в экспрессии генов
4.5.1. Геномный импринтинг
4.5.2. Аббсрации в метилировании ДНК
при психических нарушениях
5. Методические вопросы.
5.1. Обоснование использования височных долей коры головного
мозга для исследования шизофрении
5.2. Методические сложности, связанные с изучением шизофрении
5.3. Влияние постмортального интервала ПМИ
на сохранность РНК
6. Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Образцы тканей
2. Клонирование фрагментов аллелей гена 5НТ2АЯ
3. Выделение РНК, геномной ДНК и тотального белка.
Получение кДНК
4. Праймеры
5. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК
в полиакриламидном геле
6. Генотипирование
7. Измерение содержания рРНК в образцах мозга
8. Амплификация фрагментов РНК в образцах мышиного мозга
9. Измерение относительного количества мРНК гена 5НТ2АК, экспрессируемого аллелями Т и С в гетерозиготах
. Измерение количества мРНК гена рецептора 5НТ2А
. Вестернблоттинг
. Измерение степени метилирования ДНК
. Статистический анализ результатов измерений
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Определение частот аллелей С и Т гена рецептора 5НТ2А
2. Обоснование правомерности использования ЮГПЦР для измерения
уровня экспрессии генов в аутопсийных образцах тканей
2.1. Анализ общей деградации РНК в образцах мышиного мозга
2.2. Анализ общей деградации РНК в образцах человеческого мозга с различными постмортальными интервалами
2.3. Модельный анализ взаимосвязи между длиной молекулы РНК и вероятностью ее деградации
2.4. Измерения коротких фрагментов различных РНК в образцах
с разными постмортальными интервалами
3. Метод измерения относительной экспрессии аллелей
4. Экспрессия гена 5НТ2АЯ у здоровых людей и
у больных шизофренией
4.1. Методы измерения общей экспрессии гена 5НТ2АИ.
4.2. Измерение общей экспрессии гена 5НТ2АЯ у здоровых людей и больных шизофренией
4.3. Сравнение общей экспрессии гена 5НТ2АЯ у здоровых людей с разными генотипами
5. Относительная экспрессия аллелей С и Т гена 5НТ2АК
у гетерозиготных индивидов
6. Отсутствие избирательной инактивации аллелей гена 5НТ2АК
7. Метилирование гена 5НТ2АИ.
8. Методы измерения степени метилирования геномной ДНК
в Срвпарах, специфичных для аллеля С
9. Измерение степени метилирования Срйпар, специфичных
для аллеля С
. Обсуждение
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Общий уровень экспрессии гена 5НТ2А снижен в тканях мозга больных шизофренией по сравнению со здоровыми индивидами. ТА. Аллельный вариант 2 обладает двумя дополнительными по сравнению с аллельным вариантом 2ТА сайтами метилирования. Эти сайты метилированы в ДНК клеток головного мозга. Личное участие автора. Все научные результаты, положенные в основу диссертации, получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Из работ, сделанных в соавторстве, в диссертацию вошли только те результаты, в получении которых автор принимал непосредственное творческое участие. Публикации и апробация работы. По материалам исследований опубликовано пять печатных работ. Основные результаты работы докладывались на семинарах Института молекулярной генетики РАН, на Ученом Совете Медикогенетического научного центра РАМН, на собрании i в году ПуэртоРико и на ежегодных конференциях i ii i в г. Новый Орлеан, США и г. Филадельфия, США. Структура диссертации. Результаты и обсуждение, Выводы. Работа изложена на 3 страницах машинописного текста, содержит иллюстраций и 7 таблиц. Список использованной литературы содержит 9 наименований. Автор выражает глубокую признательность к. Соколову Б. П. за участие в выборе цели и методов исследования, обсуждении результатов, коллективу и ведущим специалистам отдела молекулярной генетики животных ИМГ РАН за доброжелательную поддержку работы и требовательное и всестороннее обсуждение результатов и ценные замечания. Глава 1. Обзор литературы посвящен нескольким темам, которые необходимо рассмотреть для описания современного состояния вопросов, поднятых в диссертационной работе. Рассматриваются сложившиеся к настоящему времени представления о роли серотониновой системы и различных ее компонентов в норме и при развитии психических заболеваний. Особое внимание уделяется функциональной роли рецептора 5НТ2А, ген которого является одним из основных кандидатных генов для шизофрении. Шизофрения рассматривается как сложнонаследуемое заболевание на примере шизофрении обсуждаются классические и современные методические подходы к поиску генов, вовлеченных в развитие сложнонаследуемых заболеваний. Рассматриваются подходы к диагностике, лечению и исследованию причин возникновения шизофрении обсуждаются возникающие при этом методологические сложности и способы их разрешения. Также дан обзор современных взглядов на эпигенетические механизмы, которые участвуют в обеспечении специфичности экспрессии генома и могут участвовать в развитии комплексных заболеваний, рассматривается роль метилирования в регуляции экспрессии генов. Передача сигнала от одного нейрона к другому может осуществляться электрическим или химическим путем. Последний способ обеспечивается специализированной структурой химическим синапсом, который формируется из прссинаптической и постсинаптической мембран, разделенных синаптической щелыо. Изменение потенциала на прссинаптической мембране ведет к высвобождению специального вещества, нейротрансмиттера нейромедиатора. Серотонин один из основных нейромедиаторов, используемых центральной нервной системой для передачи и модуляции сигнала. Серотонин был открыт в середине XIX века как компонент сыворотки крови, способствующий повышению сосудистого тонуса. Затем серотонин был обнаружен в мозгу, а конце х годов Раппорт с коллегами проанализировали его химическую структуру рис. Рис. Химическая структура серотонина. Серотонин не может преодолевать липофильный гематоэнцефалический барьер, поскольку он является гидрофильной молекулой. Это вещество синтезируется и утилизируется в мозгу и играет важную роль в функционировании мозга. Было обнаружено, что антагонисты и агонисты серотонина влияют на степень проявления психических отклонений. На основании этого было сделано заключение, что нарушения функции серотонина могут приводить к различным психическим заболеваниям. Роль серотонина в возникновении и развитии шизофрении подробно рассмотривается в разделе, посвященном биохимическим нарушениям при шизофрении. Рассмотрим строение и функции нейронов, содержащих серотонин серотонергических нейронов.