Биосинтез микроцина C и механизмы устойчивости клеток к антибиотику

• Автор: Новикова, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность работы

1. 2. Цели и задачи исследования

1. 3. Научная новизна и практическая значимость работы

1. 4. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Транспортные системы i. Микроцин С.

2. 1. Транспортные системы i.

2. 1. 1. Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий

2. 1.2. Каналы и поры класс 1

2. 1.2. 1. Порины

2. 1.2. 2. Специфичные каналы

2. 1. 2. 3. зависимые рецепторы
2. 1.2. 4. Аквапорины
2. 1.3. Первичные переносчики класс 3
2. 1.3. 1. Подкласс АТФзависимые транспортры
2. 1.3.2. Транспортные белки, функционирующие за счт
энергии реакции декарбоксилирования
2. 1.4. Вторичные переносчики класс 2
2. 1. 5. Фосфотрансферазная система класс 4
2. 1.6. Транспортры электронов класс 5
2. 2. Микроцин С
2. 2. 1. Микроцины
2. 2. 2. Структура МсС
2. 2. 3. тсс оперой
2. 2. 4. Система транспорта МсС
2. 2. 5. Механизм действия МсС и его клеточная мишень
2. 2. 6. Процессинг антибиотика
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. 1. Бактериальные штаммы
3. 2. Питательные среды
3. 3. Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость
к антибиотикам
3. 4. Метод ПЦР
3.5. Электрофорез в агарозном геле
3. 6. Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля
3. 7. Расщепление ДНК рестриктазами
3.8. Лигирование фрагментов ДНК
3. 9. Приготовление химически компетентных клеток . i
3. . Трансформация компетентных клеток . i
3 Получение конструкций рЕТтссЕ, рЕТ и рЕТ
тссЕТ1 а также введение мутаций в последовательность тсс оперона
3. . Трансдукция
3. . Выделение микроцина
3. . Анализ антибактериальной активности фракций МсС
3 Тест на наличие продукции МсС
3 Определение чувствительности клеток к МсС или другим соединениям
3. . Процессинг МсС
3. . Сверхпродукция белка
3. . Выделение рекомбинантного белка iагарозе
3. . Электрофорез белков в полиакриламидном геле 3 Ацетилтрансферазная реакция i vi
3. . Реакция аминоацилирования
3. . ТХУ осаждение белков
3. . Биоинформатический анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
4. 1. Биосинтез МсС
4. 1. 1. Формы МсС, продуцируемые клетками, содержащими тссАВСЕ
4. 1.2. Картирование старта тссЕ
4. 1.3. Формы МсС, продуцируемые клетками, содержащими тсс
4. 1.4. МсС структура и антибактериальная активность 4. 1.5. Заключение 4. 2. Ацетилтрансферазная активность Сконцевого домена МссЕ МссЕс 1П обеспечивает устойчивость клеток к МсС и аналогам процессированного МсС
4. 2. 1. Клетки, продуцирующие МссЕ и МссЕ. , устойчивы к
4. 2. 2. Клетки, продуцирующие МссЕ и МссЕС1и, устойчивы к аналогам процессированного МсС
4. 2. 3. МссЕС1Г обладает ацетил грансферазной активностью
4. 2. 4. Анализ ацетилированных аналогов процессированного
4. 2. 5. МссЕСТГ, несущий аминокислотные замены в ацегилтрансферазном сайте, не обеспечивает устойчивость к МсС
4. 2. 6. Ацетилированные аналоги процессированного МсС не ингибируют реакцию аминоацилирования i vi
4. 2. 7. i не участвует в синтезе МсС
4. 2. 8. Заключение
4. 3. Система транспорта МсС
4. 3. 1. Отбор клеток . i, устойчивых к МсС, и проверка сцепленности устойчивостей к и МсС
4. 3. 2. Проверка клеточных экстрактов трансдуктантов на способность процессировать МсС

4. 3. 3. Определение нуклеотидной последовательности в районе
вставки транспозона
4. 3. 4. мутанты, полученные методом направленного
мутагенеза, устойчивы к МсС
4. 3. 5. мутанты устойчивы к синтетическим аналогам зрелого
МсС, но чувствительны к аналотм его процессированной формы
4. 3. 6. Биоинформатический анализ А, , и .
4. 3. 7. Заключение
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
Список работ, опубликованных по теме диссертации
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложения
Список используемых


Основные положения и результаты работы были представлены на следующих конференциях 1 АТРii i i i i i, 1 8, , I, i 2 IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, мая, , Новосибирск, Россия 3 i i ii , i , , i, i 4 VIII i i i, , , i, i 5 IV Российский симпозиум Белки и пептиды, июня, , Казань, Россия 6 3 iii i i , 2, , , . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Транспортные системы i. Микроцин С. Обзор литературы данной диссертационной работы состоит из двух разделов. Основной раздел посвящн транспортным системам представителей семейства i, главным образом транспортным белкам . Гак как транспортная система МсС до конца не изучена, то информация, изложенная в первом разделе, представляет собой теоретическую основу для исследований транспорта антибиотика. Во втором разделе теоретической части работы подробно рассмотрены строение, синтез, механизмы активации и действия МсС, а также кратко изложены имеющиеся сведения по транспорту этого микроцииа. Транспортные системы i. Некоторые транспортные белки являются рецепторами бактериофагов i, . На основании механизма транспорта и источника энергии, используемого для функционирования, в настоящее время выделяют 7 классов транспортных белков vi. К классу I относятся каналы и поры, через которые происходит диффузия молекул но градиенту концентрации без затрат энергии. Среди вторичных переносчиков выделяют унипортсры, симпортсры и антипортеры. Унипоргеры обеспечивают транспорт одного вида молекул, симпортеры, или котранспортеры, нескольких видов молекул в одном направлении, а антипортеры осуществляют обмен одного или несколько видов молекул на другие. В класс 3 входят первичные переносчики, которые так же, как и вторичные транспортры, транспортируют вещества против градиента их концентрации. Для функционирования они используют различные виды энергии химическую, электрическую или световую энергию. Основным представителем транспортров класса 4 является фосфоенолпируватзависимая фосфотрансфераза прокариот, участвующая в транспорте углеводных остатков. Транспортная активность этого белка пощсрживается энергией, образующейся в цепи нескольких фосфотран сфераз ых реакций. К классу 5 относятся белки, ответственные за транспорт электронов через клеточную мембрану. Эти транспортные системы играют ключевую роль в поддержании мембранного потенциала. Класс 8 образуют белки, которые не являются транспортрами, а функционируют вместе с транспортными системами, выполняя различные вспомогательные функции. Они могут снабжать энергией транспортный процесс, являться структурными элементами транспортного комплекса, а также выполнять регуляторные функции. К классу 9 относятся не до конца изученные транспортные белки и белки, которые являются предсказанными транспортрами. В настоящее время классы 6 и 7 отсутствуют в системе классификации. Предполагается, что к ним будут относиться не известные на данный момент новые виды транспортных систем. Перед тем как рассмотреть транспортные системы i, необходимо отметить особенности строения клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Клеточная стенка состоит из двух мембран внешней и внутренней цитоплазматической, и находящегося между ними иериплазматического пространства, или периплазмы Рис. Периплазма содержит пептидгликановый, или муреиновый, слой. Липидный состав двух липидных слоев цитоплазматической мембраны одинаков и представлен фофефолипидами фосфатидилэтаноламином , фосфатидилглицеролом и кардиолипином. В строении внешней мембраны наблюдается ассиметричность внутренний липидный слой так же, как и липидные слои цитоплазматической мембраны, образован преимущественно фосфолипидами, однако внешний слой состоит из липополисахаридов. Липополисахариды обычно состоят из трех фрагментов липида А консервативной структуры, практически одинаковой у грамотрицательных бактерий ядра, или коровой части, относительно консервативной олигосахаридной структуры и высоковариабслыюй Оспсцифической цепи полисахарида, или Оантигена, образованной повторяющимися олигосахаридными последовательностями i . Около массы внешней мембраны . Структура всех интегральных белков внешней мембраны i бочопок. К интегральным белкам Е. ОтрА, белок ОтрХ, фосфолипаза А, протеаза ОтрТ, а также многочисленные транспортные белки i .