Молекулярный механизм антимикробного действия микроцина С

• Автор: Казаков, Теймур Спартакович
• Шифр специальности: 03.00.26, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений.

Введение

Аминоацил тРНК синтстазы

Альбомицин.
Агроцин .
Микроцин В.
Микроцин С.
Микроцин .

Пептидазы . i

Аминопептидаза А

Аминопептидаза В
Аминопептидаза
Метиониновая аминопептидаза.
Олигопентидаза А
Дипеитидаза .
Пептидаза Т.
Материалы и методы.
Бактериальные штаммы
Питательные среды.
Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость к антибиотикам.
Электрофорез в агарозном геле.
Процессинг микроцина С
Метод Г1ЦР
Извлечение фрагментов ДНК из агарозы
Биоинформатичсский анализ белков
Очистка микроцина С
Получение .
Получение 0.
Выделение плазмид.
Очистка ДНК от белковых примесей
Транскрипция i vi.
Трансформация клеток .i.
Переосаждение ДНК.
Реакция аминоацилирования.
ТХУ осаждение белков
Синтез люциферазы i vi
Результаты и обсуждение.
Процессинг микроцина С делает его активным i vi.
Внутриклеточная мишень процессированного МсС
роцессированный микроцин подавляет первую стадию реакции
аминоацилирования.
Устойчивость клеток к МсС повышается при суперпродукции
Структура процессированного МсС.
Процсссированпый МсС подавляет работу эукариотической тРНК синтстазы
Связывание процессированного МсС и мишени очень прочно
Процессинг микроцина С в цитоплазме клеткимишени.
Любая из аминопептидаз А, В или способна процсссировать МсС.
Клетки, лишнные пептидаз, производят деформилированный микроцин
Стадия деформилирования занимает половину времени процессинга интактного
микроцина.
Формильная группа МсС требуется для эффективного транспорта внутрь клетки
Структурнофункциональный анализ микроцина С
Изменение аминокислотного состава лидерного пептида может привести к
изменению активности МсС
Публикации автора по теме диссертации.
Список цитируемой литературы


Остаток АМФ также модифицирован, путем присоединения прониламина к фосфатной группе. Как реализует свои антибактериальные свойства эта химерная структура, оставалось не ясным. В данной работе мы показываем, что микроцин С относится по своему принципу действия к интереснейшей группе антибиотиков троянских коней. Принципиальное отличие таких антибиотиков состоит в том, что в ннтактном состоянии они не являются ингибиторами какоголибо клеточного процесса. Этот ряд действий со стороны клеткимишени высвобождает активную часть антибиотика, которая ингибирует свою внутриклеточную мишень. Таким образом клеткамишень сама делает вс, чтобы себя убить. Изучение микроцинов интересно само по себе, так как они отличаются необыкновенно изощренными и непохожими между собой структурами, образующимися в результате посттрансляционных модификаций. Кроме того, изучение механизмов действия микроцинов способствует получению ценных сведений о работе и структуре их мишеней ключевых ферментов в жизнедеятельности бактерий. Троянский конь, как модель действия антибиотика, становится более актуальна с учтом развития устойчивости у патогенных микроорганизмов к стандартным антибактериальным веществам. С практической же точки зрения микроцины и их более активные производные, полученные искусственным путем, могут найти применение как при лечении бактериальных инфекций микроцины активны против ряда патогенных микроорганизмов, так и как консерванты в пищевой промышленности. В случае микроцина С, появляется возможность изучать не только белки сю транспорта, мишень аспартилтРНКсинтетазу, но и ферменты, которые осуществляют его процессинг. В данной работе мы находим все ответственные за процессинг белки пептидазы и деформилазу. Возможность внесения изменений в микроциновый ген, кодирующий пептидную часть антибиотика, может позволить изучать механизм деградации олигопептидов в клетке. Присоединение аминокислоты к правильной соответствующей тРНК ключевой этап в реализации генетической информации. В самом деле, именно в данный момент язык нуклеиновых кислот переводится на язык аминокислот, в то время как на стадии трансляции происходит взаимодействие тРНК с мР К, то есть взаимодействие нуклеиновых кислот, а правильность аминокислоты, присоединенной к тРНК уже не проверяется 1, 2, 3. Продуктами реакции являются неорганический пирофосфат, АМР и аминокислота, присоединнная посредством сложноэфирной связи к 2 или 3 положению рибозы 3концсвого нуклеотида тРНК. ЛмииоацилтРНКсинтетаза имеет очень высокую специфичность к аминокислоте и тРНК. Даже в случае таких похожих аминокислот как Изолейцин и Валин количество ошибок не превышает 1 на 0 4. В основе такой точности лежит механизм проверки соответствия аминокислот и распознавание антикодоновой петли, который будет рассмотрен ниже. Несмотря на внешнее сходство тРНК между собой, аминоацилтРНК синтетазы представляют из себя группу ничем не похожих друг на друга ферментов 5. Их масса около 0 кДа, за исключением нескольких по и 0 кДа. Но, когда стала известна структура активного центра синтетаз, то сходство между ними стало более очевидно 6. По различиям в строении активного центра вокруг связывающего домена эти ферменты принято делить на 2 класса, по ферментов в каждом 7Ю. Класс I включает в себя , , i, , I, , ,. , и VтРНКсинтетазы. Ферменты работают как мономеры, за исключением Тгр и Туг , которые активны в виде гомодимеров. В мономерной глобуле можно выделить два домена концевую и Сконцевую области. Активный центр, расположенный в концсвой части синтетазы Класса I, имеет строение по типу Россмановского фолда , и отвечает за связывание А ГР. Этот тип укладки был найден ранее в дегидрогеназах, киназах и подобных ферментах, связывающих АТР или другие нуклеотиды с макроэргическими связями. Россмановский фолд состоит из Другой характерной чертой этой области являются две консервативные последовательности ii и .