Изучение нового типа мутаций, индуцированных мобильными элементами у Drosophila melanogaster

• Автор: Бирюкова, Инна Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Механизмы репрессии транскрипции у

i

1.1 Гены фупны Рс

1.2 Регуляторные элементы, ответственные за образование репреосионного комилекса

1.3 Возможные механизмы сборки репрессионного комплекса и его структура

1.4 Взаимодействия между РсСкомплсксами

1 5 Возможные механизмы репрессии транскрипции с помощью комплсксов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Генетические методы

2.1.1 Мутации и линии i , использованные в работе

2.1.2 Генетические скрещивания и создание комбинаций мутаций
2.2 Биохимические методы
2.2.1. Выделение ДНК дрозофилы для рестрикционного анализа
2 2.2 Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций
2.2.3. Саузсрнблотанализ
2.2.4. Гибридизация на фильтрах
2.2.5. Молекулярное клонирование
2 2 6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами
2.2.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса
2.2.8. Выделение РНК
2.2.9 Электрофорез РНК и гибридизация
2.2 Иммуноокрашиванис и гибридизация i i
2.2 Метод полимеразной цепной реакции ПЦР
2.2 Секвенированис плазмид и ПЦР продуктов
2.2. Создание конструкции . Р и трансформация эмбрионов дрозофилы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Генетические исследования модификатора мутаций, индуцированных встраиванием элемента
3.2 Молекулярная структура мутации i1
3.3 Транскрипция проксимальною гена вртнпн
3.4 Молекулярный анализ ревертантов мутации
3 5 Иммунолокализация белка в дистальном районе Ххромосомы
3 6 Сайты связывания химерного белка на политенных хромосомах
совпадают с новыми сайтами связывания для других белков комплекса в местах иисерции элемента
3.7 Влияние мутации на различные уаллели
3.8 Картирование последовательностей Рэлемснта, которые отвечают за ингибирование транскрипции гена в присутствии i мутации
3.9 Зависимость эффекта мутации рЙ от гомологичного спаривания
3. Влияние цисэлсмснтов на ингибирующий эффект i мутации в гене
3 Действие химерного белка РРЬ может быть супресснровано 8иу
мутациями
3 Молекулярный аналш шгГ аллеля
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4 1 Химерный белок РРЬ, обладающий ДНКсвязывающсй активностью
транспозазы, может создавать на последовательностях Лэлсмснта комплексы, состоящие из белков Регруппы
4 2 Анализ роли последовательностей Лэлемента вррепрессии транскрипции гена уеИои
4.3 Эффект мутации рЙ зависит от гомологичного спаривания
4.4 Действие мутации зависит от цисрегуляторных элементов 4 5 Активная транскрипция 1.2т.п.н. копии Лэлеменга супрессирует
ингибиторный эффект химерного РРЬ белка на экспрессию аллелей, имеющих инсерцню Лэлемента
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Создание конструкции . Действие мутации зависит от цисрегуляторных элементов 4 5 Активная транскрипция 1. Геномы живых организмов содержат разнообразные по структуре мобильные элементы МЭ. Так, например, у дрозофилы их известно более видов. Перемещение МЭ могут вызывать хромосомные перестройки, а также мутации в генахмишенях, вследствие этого они оказывают большое влияние на изменчивость видов Известно, что более половины спонтанных мугаиий, изученных у дрозофилы, индуцированы МЭ. Одним из наиболее изученных МЭ у дрозофилы является элемент, элемент кодирует фермент транспозазу, который связывается с концевыми последовательностями элемегтта и катализирует его транспозиции в геноме. Мутагенный эффект элемента зависит от места ег о встраивания, ориентации и точности его вырезания в генемигпени Известно, что элементы часто встраиваются в про моторную область генамигпени После вырезанггя элемента часто остаются сто концевые последовательности, которые могут участвовать в регуляггии транскрипции гена. Настоящая работа посвящена изучению нового типа мутаций, индуцированных МЭ. Нами была получена мутация в гене ро1уЫткоЧс рИ, вызванная иисерцией элемегтта. В результате этого в присутствии химерного белка РРЬ все Рэлемеиты в геноме потенциально становятся точками образования репрессиоиных комплексов, которые могуг модифицировать транскрипцию рядом расположенных генов. Не исключено, что такого типа мутации могуг возникать и в других регуляторных белках. Образовавшиеся в результате химерные белки могут регулировать экспрессию геновмишеней, в которых есть инсерция элемента При этом образуется новая регуляторная система, которая может быстро эволюционировать, так как Рэлемент активно перемещается по геному дрозофилы. Оптимальное количество сайтов связывания химерного белка может быстро подбираться за счет происходящих дупликаций Лэлемента или его частичных делений, в результате которых возникают стабильно интегрированные в геном части элементов Таким образом может происходить быстрая эволюция регуляторных систем, что во многом определяет скорость эволюции в целом. Основная цель данной работы состояла в изучении и описании нового типа мутаций, индуцированных мобильными элементами. В нашей лаборатории был проведен генетический и молекулярный анализ модификатора фенотипического проявления мутаций в гене уеИом, индуцированных встраиванием элемента. В процессе развития эукариотического организма происходит переход от единичной полипотентной клетки к системе органов и тканей, в которых клетки находятся в дифференцированном состоянии В отличие от начальной стадии эмбрионального развития, где функционально активным может быть каждый ген, в любой, отдельно взятой дифференцированной клетке работает свой, строго определенный набор генов, тогда как остальные находятся в репрессированном состоянии. Другими словами, в процессе развития наблюдается возрастающее состояние репрессии Очень важно, чтобы экспрессия генов, отвечающих за правильную закладку тканей, находилась под строгим контролем, иначе могут произойти необратимые нарушения в развитии организма Таким образом, правильная ткане и врсмсспсцифичность репрессии транскрипции играют важную роль в развитии и поддержании дифференцированного состояния клетки Ниже будут расмотрсн механизм репрессии как отдельных генов, так и целых генных комплексов на примере известных рспрсссоров транскрипции белков группы , . Впервые семейство генов, регулирующих транскрипцию на уровне образования структурных комплексов, было описано у i i. В дальнейшем гомологичные гены были найдены у млекопитающих , . X vi i , . Репрессия транскрипции ка уровне хроматина имеет особое значение в процессе раннею развития дрозофилы, когда от экспрессии ключевых юнов зависит правильная закладка сегментов и органов Раго , Гомеознсные гены определяют детерминацию сегментов и органов дрозофилы . I.i.