Молекулярные механизмы регуляции тропомиозином актин-миозинового взаимодействия

• Автор: Карпичева, Ольга Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 144 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Актин.
1.2. Миозин

1.3. Области взаимодействия актина и миозина.

1.4.Тропомиози н.

1.4.1. Струю ура тропомиозина

1.4.2. Взаимодействие тропомиозина с актином .

1.4.3. Изоформы тропомиозина.

1.4.4. Мутации тропомиозина, связанные с наследственными заболеваниями мышц

1.4.5. Регуляция тропомиозином актинмиозинового взаимодействия
1.5. Кальдесмон
1.5.1. Структура кальдесмона .
1.5.2. Регуляция кальдесмоном актинмиозинового взаимодействия.
1.7. Применение метода поляризационной микрофлуориметрии для изучения мышечного сокращения.
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Получение глицеринизированных мышечных волокон
2.2. Получение теневых волокон.
2.3. Получение актина и реконструкция актиновых нитей в теневом волокне
2.4. Получение субфрагмента1 миозина
2.5. Получение гладкомышечного тропомиозина и кальдесмона
2.6. Связывание мышечных белков с актином теневых волокон.
2.7. Получение рекомбинантного тропомиозина
2.7.1. Клонирование последовательности ДНК, кодирующей тропомиозин
2.7.2. Экспрессирование белка.
2.8 Получение рекомбинантного тропонина.
2.9. Измерение концентрации белков.
2 Электрофорез в полиакриламидном геле
2 Измерение АТФазной активности актомиозина.
2 Определение способности связывания скелетного тропомиозина с актином.
2 Измерение спектров кругового дихроизма
2 Окрашивание мышечных белков флуоресцентными красителями
2 Метод поляризационной микрофлуориметрии.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Влияние нуклеотидов на структурное состояние субфрагмента1 миозина в АТФазном цикле
3.2. Влияние субфрагмента1 миозина на структурное состояние актина в АТФазном цикле
3.3. Влияние скелетного тропомиозина на структурное состояние субфрагмента1 миозина и актина в АТФазном цикле
3.4. Влияние субфрагмента1 миозина на структурное состояние скелетного тропомиозина в АТФазном цикле.
3.5. Влияние тропонина и Са2 на конформационные изменения актина, миозина и тропомиозина в АТФазном цикле.
3.6. Влияние кальдесмона и гладкомышечного тропомиозина на структурное состояние субфрагмента1 миозина и актина в АТФазном цикле.
3.7. Движение и Сконцевых областей гладкомышечного тропомиозина в цикле гидролиза АТФ
3.8. Влияние мутаций 7 и 7 в скелетном тропомиозине на его структурнофункциональные свойства.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Наоборот, при высокой концентрации Са2 тропонин сдвигает тропомиозин ближе к центру актиновой нити при формировании сильной формы связывания миозина с актином и дальше к периферии актиновой нити при слабом связывании этих белков, таким способом увеличивая амплитуду внутримолекулярных движений актомиозина в цикле гидролиза АТФ, что может приводить к увеличению эффективности работы поперечных миозиновых мостиков. Мутации 7 и 7 тропомиозина, связанные с наследственной немалиновой миопатией, вызывают смещение тропомиозинового тяжа к периферии актиновой нити и ингибируют движения тропомиозина на поверхности актина в цикле гидролиза АТФ, что может вызвать нарушение согласованной работы ансамбля мышечных белков, сдвигая равновесие сократительной системы к слабосвязанному структурному состоянию. Впервые показано, что в мышечном волокне в АТФазном цикле существует несколько структурных состояний актомиозиновой системы, отличающихся друг от друга подвижностью и пространственной организацией 1 спирали миозина и субдомена 1 актина. Каждому промежуточному состоянию актомиозина соответствует определенное структурное состояние тропомиозина, характеризуемое различной подвижностью и позицией этого белка на поверхности актиновой нити. Получены приоритетные данные, указывающие на то, что регуляция актинмиозинового взаимодействия в скелетных и гладких мышцах может осуществляться взаимозависимыми конформационными изменениями актина, миозина и тропомиозина. Показано, что тропонин и Са2 способны модифицировать влияние нуклеотидов на структурное состояние ансамбля актина, миозина и тропомиозина, что может быть причиной активации гидролиза АТФ при высокой концентрации Са2 и ингибирования гидролиза при низкойконцентрации Са2. АТФ. Впервые показано, что одной из причин ослабления сократительной функции скелетных мыщц при немалиновой миопатии является ингибирование движения тропомиозина по поверхности тонкой нити в цикле гидролиза АТФ. Полученные данные расширяют и углубляют представления о молекулярных механизмах клеточной подвижности и могут быть использованы при чтении курсов лекций по цитологии, клеточной биологии, биофизике, биохимии и физиологии. Впервые обнаруженное нами ингибирование движения скелетного тропомиозина по поверхности тонкой нити в цикле гидролиза АТФ, вызванное мутациями С1иу и б1п7Рго тропомиозина, имеет большое значение для выяснения молекулярных механизмов ослабления сократительной функции скелетных мышц при наследственной немалиновой миопатии. Глава 1. Современные представления о механизмах мышечного сокращения основаны на фундаментальном открытии, сделанном в году x, i, x, , . Используя интерференционный микроскоп, авторы независимо друг от друга установили, что укорочение саркомера при сокращении мышцы происходит в результате продольного скольжения тонких актиновых и толстых миозиновых нитей друг относительно друга. Дальнейшие исследования показали, что миозиновые молекулы циклически взаимодействуют с актиновыми нитями, используя химическую энергию АТФ около кДжмоль, освобождаемую в результате гидролиза в активном центре головки миозина Энгельгардт, Любимова, . Запуск сокращения происходит при увеличении концентрации Са2 в цитоплазме клетки. Посредниками в процессе передачи Са2сигнала являются регуляторные белки. Важную роль в регуляции сокращения гладких и поперечнополосатых мышц играет белок тонких нитей тропомиозин. В настоящей главе мы рассмотрели данные о структуре и функции мышечных белков актина, миозина, тропомиозина и кальдесмона, наиболее важные аспекты регуляции взаимодействия миозина с актином, а также результаты исследования механизмов мышечного сокращения с использованием метода поляризационной микрофлуориметрии. Актиновые нити актин, образуются в результате поликонденсации глобулярных мономеров актина в виде двух правозакрученных спиралей, обвивающих друг друга рис. Рисунок 1. Ленточная модель строения актина а и актина б, основанная на данных электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа . . Рскладчатости обозначены стрелками.