Перенос генов в клетки костного мозга с помощью лентивирусных векторов ex vivo

• Автор: Радюхина, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.25, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 164 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Участие клеток костномозгового происхождения в репарации сосудистой стенки

после повреждения1

Способы переноса генов

Перенос генов x viv.

Перенос гено.в i viv

Ретровирусные системы переноса генов

Структура генома и жизненный цикл ретровирусов

Векторы на основе лентивирусов

Промоторы, используемые для обеспечения экспрессии трансгена в клетках
костномозгового происхождения и сердечнососудистой системы.
Явление генетического мозаицизма
Роль эпигенетических модификаций в экспрессии трансгена.
Разработка подходов к генотерапии с использованием вирусных векторов Безопасность использования ретро и лентивирусных векторов для целей
генной терапии
Выделение субпопуляций клеток костного мозга, обогащенных
гемопоэтическими стволовыми и прогениторными клетками.
Методы тестирования потенциала СК.
Маркеры гемопоэтических стволовых клеток
Выделение субпопуляций клеток костного мозга на основе различий в
экспрессии поверхностных маркеров.
Использование лентивирусных векторов для переноса генов в костномозговые
клетки
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы.
Животные
Клеточные культуры
Лентивирусные конструкции.
Антитела
Химические реагенты
Методы.
Выделение субпопуляций прогениторных клеток из костного мозга мыши
Выделение клеток костного мозга мыши.
Выделение клеток костного мозга с фенотипом ii.
Выделение клеток костного мозга с фенотипом i iГ.
Выделение клеток костного мозга с фенотипом
Получение препаратов псевдовирусных частиц.
Трансдукция клеток с помощью лентивирусной конструкции.
Трапсдукция клеток линии III
Трансдукция клеток костного мозга
Получение гсмопоэтических колоний в селезенках у летально облученных
Приготовление суспензии клеток селезеночных колоний
Морфологический анализ селезеночных колоний
Иммун о гистохимический анализ гистологических срезов селезенок
Длительное восстановление кроветворения у летально облученных мышей
Иммуиоцитохимическос исследование клеток костного мозга и селезеночных
колоний
Поточная цитофлуориметрия
Выявление хромосомпого маркера и фрагмента векторной ДИК в клетках
костного мозга и селезеночных колоний у химерных мышей.
Выделение ДНК
Полимеразная цепная реакция
Электрофорез ДНК.
Статистическая обработка данных
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Трансдукция клеток с помощью лентивекторной конструкции i vi
Трансдукция клеток костного мозга
Сравнительное исследование способности экспрессионных 1V и IVвекторов XIН1 и V 1 трансдуцировать клетки костного мозга.
Сравнительное исследование способности промоторов V и V
обеспечивать экспрессию трансгена в клетках костного мозга.
Трансдукция клеток костного мозга с фенотипами iii, iiГ и
.
Трансдукция клеток линии III
Анализ результатов трансдукции i viv
Получение гсмопоэтических колоний в селезенках у летально облученных
Тестирование результатов трансдукции методом селезеночных колоний с
использованием вектора V I
Тестирование результатов трансдукции методом селезеночных колоний с
использованием вектораV 1.
Морфологическое исследование гистологических срезов селезенок.
Иммуноцитохимическое исследование клеток селезеночных колоний.
Длительное восстановление кроветворения у легально облученных мышей
Иммуноцитохимический анализ клеток костного мозга химерных животных
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


При этом, некоторые исследователи полагают, что клеткипредшественники эндотелия и гладких мышц в зависимости от тяжести повреждения и особенностей репарации сосудов могут быть востребованы из различных источников . Существование прямой зависимости между развитием интимальной гиперплазии и функционированием системы кроветворения обнаружено в целом ряде исследований. В пользу этого факта свидетельствуют данные о том, что атеросклеротические изменения в артериях мышей, нокаутных по белку АроЕ, могут быть практически сведены к нулю при трансплантации таким животным клеток костного мозга мышей дикого типа i . Было показано, что временное подавление миелоидного кроветворения предотвращает развитие неоинтимы после баллонного повреждения коронарных артерий у кроликов i . Аналогичный эффект наблюдался при подавлении активности белка хемоаттракганта моноцитов1 МСР1 i1, мобилизующего мононуклеарные фагоциты из тока крови в очаг поражения сосудистой стенки при развитии атеросклероза . Наконец, в работе i . Первые наблюдения об участии циркулирующих в крови клеток предшественников в патологической перестройке артерий были сделаны уже около сорока лет назад. Еще в году . ГМК, приходящими из крови. В работах последних лет, опубликованных несколькими независимыми группами ученых, приводятся данные, прямо указывающие на костномозговое происхождение клеток, участвующих в ремоделировании артерий после трансплантации органов. Для доказательства этого факта применялись различные модели пересадок сердца и сосудов у крыс и мышей, в которых в качестве маркеров клеток костного мозга были использованы антигены класса II МНС v . В работе i . ГМК имели маркер пересаженных клеток костного мозга. В году была опубликована работа . В опытах i vi они продемонстрировали возможность дифференцировки выделенных из костного мозга гемопоэтических стволовых клеток с фенотипом ii1 в эндотелиальные и гладкомышечные клетки. Для исследования роли клеток костного мозга как источника ГМК участвующих в репарации стенки артерии после механического повреждения в работе использовали облученных мышей, у которых собственный костный мозг был заменен костным мозгом трансгенных животных. Оказалось, что в области репарации артерии более интимальных и медиальных клеток оказались , то есть имели костномозговое происхождение. Г, выделенные в виде чистой популяции из костного мозга трансгенных мышей, экспрессирующих ген , превращаются в альфаактинпозитивные эндотелиальные и гладкомышечные клетки. Экспериментальные доказательства участия клеток костного мозга в репарации сосудов после повреждения ранее были получены и в нашей лаборатории. Иммуноцитохимические и авторадиографические исследования кинетики пролиферации клеток, участвующих в репарации сонной артерии крысы после повреждения показало, что они имеют скорее гематогенное, чем местное происхождение Ильинская и соавт. Нами также были приведены доказательства костномозгового происхождения клеток, участвующих в образовании неоинтимы после баллонной ангиоплатики сонных артерий химерных крыс, с маркированными по хромосоме клетками костного мозга. При этом было показано, что в области репарации артерии значительную долю составляли клетки, несущие маркер донорских клеток хромосому, что свидетельствовало о костномозговом происхождении этих клеток Ильинская и соавт. Тарарак и соавт. Важно отметить, что факты, доказывающие актуальность подобного научного подхода были получены и при изучении атеросклероза у человека. В частности, было показано, что в интиме атеросклеротических аорт, а также в крови больных семейной гиперхолестсринемией с ангиографически верифицированным атеросклерозом, в отличие от крови здоровых людей, присутствуют костномозговые клетки предшественники. При этом часть из них i vi образует колонии клеток гсмопоэтичсской линии дифференцировки моноцитовмакрофагов, базофиловтучных клеток и др. Эти данные свидетельствуют о том, что атеросклероз, повидимому, поражает не только стенку артерий, но является системным заболеванием, которое затрагивает также периферическую кровь и костный мозг, а в нем, компартменты стволовых гсмопоэтических и стромальных клеток Соболева, Попкова, v . Соболева и соавт.