Изменение организации цитоскелета эндотелиальных клеток при индукции экзоцитоза телец Вейбеля-Палада

• Автор: Виноградова, Татьяна Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 175 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эндотелий и тельца ВейбсляПалада.

1.1 .Тельца ВейбеляПаллада, фактор Виллибранда.

1.2. Особенности организации цитоскелета эндотелиальных клеток и И экзоцитоз тВП.

1.3. Воздействие тромбина на эндотелиальные клетки

2. Цитоскелет и внутриклеточный транспорт

2.1. Система микротрубочек.

2.2. Актиновый цитоскелет

2.3. Промежуточные филамснты.

3. Центросома.

3.1. Структура и состав центросомы.
3.2. Роль центросомы в клеточном цикле и митозе.
3.3. Редупликация центросомы
3.4. Центросома и внешние сигналы
4. Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Клеточные культуры
1.1. Культура эндотелиальных клеток аорты человека
1.2. Культура эндотелиальных клеток пупочной вены человека
2.Иммунофлюоресцентные исследования
3. Электронная микроскопия
3.1. Стандартная электронная микроскопия
3.2.Иммуннопероксидазнос окрашивание для электронной микроскопии
4. Реактивы, использованные в работе
5. Статистическая обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Структура цитоскелета и локализация телец ВейбеляПаллада в клетках культуры эндотелия аорты.
2. Перераспределение тВП в клетках, инкубированных с тромбином.
3. Перераспределение тВП в клетках, обработанных колцемидом.
4. Перераспределение тВП в клетках инкубированных в среде с цитохалазином В.
5. Перераспределение телец ВП в клетках, обработанных каликулином А
6. Является ли движение тВП к центросоме специфической реакцией всех эндотелиальных клеток человека, или эта реакция характерна только для
НАЕС
6.1. Воздействие тромбина на клетки культуры Ни УЕС.
6.2. Воздействие цитохапазина Б на клетки культуры НиУЕС
6.3. Воздействие каликулина А на клетки культуры НЦУЕС
7. Реорганизация центросомы в эндотелиальных клетках при
воздействиях, вызывающих образование кластеров тВП у ЦОМТ.
7.1. Подсчет количества сателлитов в эндотелиальных клетках до и на ранних сроках после добавления тромбина
7.2. Иммуноэлектронное окрашивание центросомальной области эндотелиальных клеток антителами к посттрансляционно модифицированному тубулину.
7.2.1 Окрашивание клеток НАЕС антителами к тирозинированному
ф тубулину
7.2.2. Окрашивание клеток V антителами к тирозинированному
тубулину
7.1.3.Окрашивание клеток НАЕС антителами к ацетилированному
тубулину
7.1.4. Окрашивание клеток V антителами к ацетилированному
тубулину
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Перемещение тВП к центросоме
2. Взаимодействие тВП с компонентами цитоскслета
3. Изменение организации цешросомы в эндотелиальных клетках при действии тромбина
3.1. Изменение числа центриолярных сателлитов в НАЕС
3.2.Изменение интенсивности окрашивания центриолей ЭК антителами к пост трансляционно модифицированному тубулину при действии тромбина
4. Различия в транспорте и распределении тВП в эндотелиальных клетках,
выделенных из аорты и пупочной вены человека
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Основная функция этих органелл состоит в накоплении запасного пула секреторного белка эндотелиальных клеток фактора Виллибранда ФВ и обеспечении его массового выброса в ответ на действие внешних факторов. Фактор Виллибранда представляет собой гликопротсин с большим молекулярным весом, синтезируемый сосудистым эндотелием и мсгакариоцитами . В кровяном русле ФВ способен играть роль молекулярного мостика соединяющего клетки эндотелия с тромбоцитами при образовании тромба при различных поражениях сосудов . В плазме ФВ существует в виде гетерогенных мультимеров с 0. В клетке ФВ синтезируется в виде предшественника с 0. Затем препоследовательность отщепляется, а субъединицы объединяются сначала в димеры, а затем в мультимеры. Выброс ФВ из эндотелиальных клеток происходит двумя путями постоянное фоновое освобождение ФВ из клетки . Возможность массового регулируемого выброса обеспечивается за счет существования в клетке большого запасного пула ФВ, сосредоточенного в тВП. Наряду с ФВ тельца ВейбеляПаллада содержат также белок, участвующий в межклеточной адгезии 0 i. Этот белок, считавшийся характерным для клеточной мембраны тромбоцитов, был затем обнаружен и в мембране тВП i . Функция этого белка в тВП еще остается неясной. Однако известно, что после выброса тВП из клетки 0 попадает на клеточную мембрану, после чего происходит быстрый обратный транспорт этого белка в клетку путем эндоцитоза . Эндотелиальные клетки, дефицитные по ФВ теряют способность к образованию тВП и к регулируемому высвобождению интерлейкина8 и 0 v i . Ряд агентов, таких как тромбин, РМА, вазоактивные амины и др. ВейбеляПаллада. При биохимическом измерении количества ФВ в среде культивирования клеток было показано, что увеличение его уровня начинается сразу же после стимулирующего выброс воздействия и достигает максимума к минутам . При иммунофлуоресцентном окрашивании к ФВ видно, что к минутам после начала воздействия клетки эндотелия пупочных вен теряют характерное гранулярное окрашивание цитоплазмы. Интересно, что через минут около клеточной мембраны обнаруживаются небольшие вакуоли, мембраны которых метятся антителами к ФВ i . Одновременно с выбросом тВП тромбин усиливает внутриклеточный синтез ФВ, что выявляется методом иммунофлуоресценции по диффузному окрашиванию околоядерной зоны, где начинает синтезироваться предшественник ФВ v . Особенности организации цитоскелета эндотелиальных клеток и экзоцитоз тВП. ТВП представляют собой достаточно большие клеточные органеллы и, учитывая все, что на настоящий момент известно о транспорте органелл, резонно предполагать, что цитоскелет должен быть задействован в перемещение тВП. СаЙнхе и Вагнер показали, что при разрушении сети мнкротрубочек в клетках V с помощью колхицина или нокадозола происходит трехкратное уменьшение экзоцитоза ФВ в ответ на действие стимулирующих секрецию агентов тромбина и А7 i, , . Длительная инкубация эндотелиальных клеток в среде с разрушающими МТ агентами приводила к полному исчезновению тВП из клеток, а новообразующийся ФВ образовывал комплексы меньшего размера, чем в контрольных клетках, и был диффузно рассеян по цитоплазме. В дополнение, ряд работ дает косвенные данные для предположения, что организация цитоскелета эндотелиальных клеток взаимосвязана с количеством запасаемых тВП иуровнем высвобождения ФВ. Так, с одной стороны Молони и Армстронгом было показано, что длительное воздействие до часов тромбина и РМА вызывает изменение в организации актинового цитоскелета и перераспределение стрессфибрилл, с другой Рейндерс с соавторами показали, что эти же воздействия приводят к увеличению накопления клетками тВП, хотя уровень ФВспецифической мРНК при этом не изменяется i . Аналогично, увеличение давления потока жидкости на монослой культивируемых эндотелиальных клеток приводит как к изменению формы клеток и перестройке актинового цитоскслста i . ВП . РНК для ФВ. Как показывают работы двух групп исследователей, полярность постоянной и регулируемой секреции ФВ может различаться в эндотелиальных клетках.