Исследование генома макронуклеуса инфузорий рода Paramecium методом пульс-электрофореза в норме и при внутриядерной бактериальной инфекции

• Автор: Потехин, Алексей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 178 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Феномен гетероморфизма ядер. Микронуклеус и макронуклеус

2. Формирование генома макронуклеуса.

2.1. Этапы диминуции хроматина.

2.2. Вклад эпигенетических эффектов.

2.3. Присоединение теломеров и амплификация фрагментов ДНК

3. Деление макронуклеуса и поддержание постоянства его генома

4. Геномы инфузорий. Гены, карты, методы исследования

4.1. Картирование геномов микронуклеуса и макронуклеуса

4.2. Молекулярные подходы к изучению содержания генома
макронуклеуса инфузорий л.
4.3. Пульсэлектрофорез теория метода1 исследования
эукариотических геномов
4.4. Пульсэлекгрофорез как способ кариотигшрования протистов.
ПЭФ метод изучения генома макронуклеуса инфузорий
5. Ядра инфузорий как удобный компартмент для
колонизации бактериальными эндобионтами
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
I. МАТЕРИАЛЫ.
II. МЕТОДЫ.
1. Методы лабораторной работы с инфузориями и их эндобионтами.
1.1. Культивирование инфузорий.
1.2. Экспериментальное заражение парамеций эндобионтами
1.3. Освобождение инфузорий от эндобионтов с помощью
антибиотиков
2. Сравнительный анализ геномов парамеций.
2.1. Пульсэлектрофорез.
2.1.1. Приготовление препаратов ДНК.
2.1.2. Проведение пульсэлектрофореза.
2.2. Денситометричсский анализ электрокариотипов
2.3. Блотгибридизация по Саузерну
2.3.1. Использованные пробы.
2.3.2. Проведение гибридизации и детекции метки.
2.4. Полиморфизм длин фрагментов рестрикции.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Анализ методом пульсэлектрофореза.
Понятие электрокариогип макронуклсуса.
1.1. Исследование электрокариотипа i
1.2. Геномы других видов i.
1.3. Другие виды инфузорий
2. Анализ методом гибридизации по Саузерну
3. Влияние внутриядерных эндобионтов на геном макронуклеуса парамеций
4.Ана.1из полиморфизма длин фрагментов рестрикции
ОБСУЖДЕНИЕ.
1.Молекулярные составляющие электрокариотипа
i
1.1. Природа и постоянство спектра молекул, получаемого в ходе
пульсэлектрофореза
1.2. Природа полос в электрокариогипах i.
2. Электрокариотипы сингенов видовдвойников.
3. Особенности гибридизационного паттерна
у разных видов инфузорий
4. Влияние внутриядерных бактериальных эндобионтов
на геном макронуклеуса.
5. Молекулярная композиция генома макронуклеуса
как систематический признак ii.
6. Эволюция генома макронуклеуса
и картирование генома i
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


, . Показано, что может происходить альтернативное использование сайтов фрагментации, приводящее к появлению в МА нескольких имеющих одинаковое происхождение, но при этом различных молекул ДНК i . . Наконец, у i недавно обнаружена короткая консенсусная сигнальная последовательность фрагментации, сходная с сигналом разрезания . В отличие от сигналов она не имеет точной локализации, но всегда выявляется в произвольных сайтах 5 и Зсубтеломерных участков молекулы, получаемой после фрагментации. Возможно, дополнительным сигналом служит высоко упорядоченная структура субтеломерных участков, состоящих из инвертированных повторов и палиндромов . Политенизацию хромосом при развитии нового МА наблюдали у многих инфузорий, представляющих разные классы , класс i, i, i, , класс i, x класс i и i класс . i, , . К сожалению, у большинства из них никогда детально не исследовали цитологические и молекулярные механизмы дальнейшего формирования генома МА. По недавно полученным данным i, , известно, что для многих из них отчасти характерна достаточно интенсивная фрагментация хромосом МИ, приводящая к наличию в МА наряду с достаточно крупными фрагментами ДНК молекул, несущих по одному гену то есть, таких же, какие формируют геном МА у брюхоресничных. У других модельных инфузорий и i политенизации хромосом не происходит. Однако общие с брюхоресничными черты можно выделить. В первые часы после конъюгации у также происходит удаление ВЭП основная диминуция хроматина из развивающегося МА происходит именно на этой стадии развития. Сайтов, по которым происходят события эксцизии и ДНКсплайсинга, примерно в пяти хромосомах МИ . У этой инфузории ДНКсплайсинг осуществляется не идеально точно, и в сайтах соединения свободных концов выявляется микрогетерогенность, достаточная для дальнейших ошибок в матричных процессах см. . Вероятно, поэтому у ВЭП никогда не находили в кодирующих последовательностях генов. Известно, что ВЭП могут быть локализованы в интронах генов, а значит, подвергаются транскрипции i, , . Такая локализация ВЭП все равно требует весьма точного механизма их удаления, так как неверная эксцизия может привести к нарушению сплайсинга РНК. Действительно, перестройка хромосом МИ идет с высокой точностью, которую обеспечивают несколько консенсусных последовательностей. Так, концы ВЭП представлены короткими менее 8 п. ВЭП располагается регуляторная последовательность . Одновременно с ВЭП удаляются также трансиозонные элементы семейства Те11, на концах которых располагаются теломерные повторы С4А2 в молекулах ДНК МА тетрахимен внутренние теломерные последовательности отсутствуют , , . У парамеций также обнаружены ВЭП впервые девять ВЭП, чей суммарный размер составляет около т. МИверсии поверхностного антигена А . . У парамеций были обнаружены ВЭП размером от до 2 п. i, i, . ВЭП i фланкированы двойным прямым повтором ТА, и их эксцизия происходит со стопроцентной точностью, что роднит их с ВЭП не очень филогенетически близкого рода и подтверждает их общее происхождение от транспозонов i. На концах всех ВЭП обнаружена консенсусная последовательность из 8 п. ВЭП из генома . Вырезанные ВЭП размером более 0 п. i имеют, как правило, кольцевую структуру i . Эго позволяет предполагать, что эксцизия ВЭП может осуществляться путем рекомбинации между концами элиминирующейся последовательности i, ii, . Однако более короткие ВЭП вырезаются в линейной форме, что говорит в пользу гипотезы о вторичности кольцевой структуры элиминированных длинных ВЭП i, i, .