Механизмы регуляции функциональной активности рецептора инозитол-1,4,5-трисфосфата эндоплазматического ретикулума

• Автор: Глушанкова, Любовь Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 83 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Роль инозитол 5трисфосфата1п5Рз в передаче

внутриклеточного сигнала.

1.2 Структура и функции рецептора I3

1.2.1 Локализация и типы рецептора I3

1.2.2 Молекулярная структура I3

1.2.3 Функциональные свойства I3

1.2.4 Факторы, влияющие на активацию I3.

1.3 Рианодиновый рецептор
1.4 СаМ кальций зависимый белок
1.4.1 Структура и функции СаМ
1.4.2 Действие СаМ на вход Са2через
потенциал зависимые Са2 каналы
1.4.3 Действие СаМ на выход Са2 через рианодиновые i
1.4.4 Действие СаМ на I3 индуцированный
вход кальция
1.5 Депоуправляемый вход кальция в клетку.
1.6 Каналы, активируемые выбросом кальция .
1.7 Каналы семейства .
1.8 Гипотезы о механизме регуляции
депозависимых кальциевых каналов.
1.9 Конформационное сопряжение.
1. Низкопроводящие кальциевые каналы Ii
1. Регистрация внутриклеточной концентрации
кальция с помощью флуоресцентных зондов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Клетки
2.2 Материалы
2.3 Получение рекомбинантных бакуловирусов.
2.4 Регистрация ионных токов и обработка
экспериментальных данные
2.5 Экспрессия и очистка рекомбинантного
белка 1П5Р3РПН
2.6 Анализ связывания с 3Н1пбРз
2.7 Анализ связывания с 5ЬР1Р
2.8 Эксперименты на бислойной липидной мембране
2.9 Регистрация внутриклеточной концентрации кальция РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Специфическое связывание 1пзР3Р с 1пзР
аденофостином А АсА, а также антагонистом 1пзР3Р водорастворимым Р1Р2.
3.2 Роль лигандсвязывающего домена 1пзР3Р
в регуляции активности 1т1п каналов.
3.3 Роль высокоаффинного кальцийзависимого сайта
связывания с СаМ в регуляторном домене 1пР3Р
3.3.1 Мутация V в 1пвР3Р крысы отменяет кальцийзав исимое взаимодействие с СаМ.
3.3.2 Модулирование активности рекомбинантного 1пзР3Р. цитозольным кальцием.
3.3.3 Роль кальмодулина в модулировании активности рекомбинантного 1пбРзР цитозольным кальцием.
3.3.4 Ингибирование 1пбР3Р кальмодулином.
Благодарности
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
аденофостин
БЛМ бислойная липидная мембрана
концентрация свободных ионов кальция в цитоплазме
циклическая аденозиндифосфат рибоза
СаМ кальмодулин
циклический гуанозинмонофосфат
канал, активируемый выбросом кальция из депоса1оит
iv диацилглицерин
дезоксирибонуклеиновая кислота дигидропиридиновый рецептор гуанозин5дифосфат гуанозин5трифосфат этиленгликольтетрауксусная кислота флуоресцентный кальциевый зонд ацетометильный эфир 2 кажущаяся константа связывания Iiканалы миниатюрные каналы I3 инозитол1,4,5трисфосфат
рецептор инозитол1,4,5трисфосфата лигандсвязывающийдомен рецептора инозитол
1,4,5трисфосфата
1,5, изопропилтиорогалактоза вероятность открытого состояния канала килодальтон
плазматическая мембрана полиэтиленгликоль протеинкиназа А
фосфатидилинозитол4,5бисфосфат водорастворимый аналог фосфатидилинозитол4,5бисфосфата
антитела к фосфатидилинозитол4,5бисфосфату фосфолипаза С рианодиновый рецептор саркоплазматический ретикулум
кальциевые АТФазы эндосаркоплазматического ретикулума депоуправляемый канал
i i временный рецепторный потенциал
6аминогексил5хлоро1нафталенсульфонамид фотоэлектронный умножитель эндоплазматический ретикулум
ДНК


2
I
I3

ПМ

I




ЭР
ВВЕДЕНИЕ.
Общая характеристика работы.
Актуальность


Факторы, влияющие на активацию I3. Депоуправляемый вход кальция в клетку. Каналы, активируемые выбросом кальция . Каналы семейства . Конформационное сопряжение. Получение рекомбинантных бакуловирусов. А АсА, а также антагонистом 1пзР3Р водорастворимым Р1Р2. Мутация V в 1пвР3Р крысы отменяет кальцийзав исимое взаимодействие с СаМ. Модулирование активности рекомбинантного 1пзР3Р. Роль кальмодулина в модулировании активности рекомбинантного 1пбРзР цитозольным кальцием. Ингибирование 1пбР3Р кальмодулином. ВВЕДЕНИЕ. Общая характеристика работы. Актуальность проблемы. Кальций является одним из универсальных регуляторов многочисленных процессов, происходящих в клетке таких, как секреция, сокращение, пролиферация и генная регуляция. Передача физиологически важных сигналов от рецепторов плазматической мембраны к внутриклеточным структурам осуществляется путм повышения концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме Са2. В невозбудимых клетках рецепториндуцированные изменения 2, обычно включают две составляющие быстрое, кратковременное высвобождение Са2 из Са2депо представленных эндоплазматическим ретикулумом ЭР или его субкомпартментами и последующий медленный, но продолжительный вход Са2 из внеклеточной среды. Рецепторы, сопряженные с белками или тирозиновыми киназами, активируют фосфолипазу С . Активированная гидролизует мембраносвязанный фосфолипид фосфатидилинозитол4,5бисфосфат Р1Р2, в результате чего образуется водорастворимый инозитол1,4,5трисфосфат I3 и диацилглицерин . Связывание I3 с рецептором инозитол1,4,5трисфосфата I3, являющимся катионным каналом эндоплазматического ретикулума, приводит к высвобождению Са2 из внутриклеточных депо. Хотя механизм выброса Са2 из внутриклеточных депо достаточно хорошо изучен, механизмы, регулирующие связывание I3 с рецептором, а также молекулярная организация данного комплекса продолжают вызывать интерес. Важнейшим свойством I3 является бифазная регуляция его активности цитозольным кальцием v i, . Именно это свойство рецептора определяет пространственновременной ход кальциевой волны в клетке. I3 ii . В результате опустошения Са2депо понижения концентрации свободных ионов Са2 в депо активируются депоуправляемые катионные каналы, обеспечивающие вход Са2 в клетку. Благодаря входу Са2 его концентрация в цитоплазме поддерживается длительное время вплоть до нескольких десятков минут на высоком уровне, что приводит к запуску Са2зависимых сигнальных каскадов, а также к восстановлению запасов Са2 в депо , , , i, . Одна из основных моделей активации каналов подразумевает белокбелковое взаимодействие между I3 эндоплазматического ретикулума и каналами плазматической мембраны , , i, . Однако до конца остается неясным, каким образом сигнал о понижении концентрации Са2 в депо передается к каналам плазматической мембраны. Изучение механизмов кальциевой сигнализации в невозбудимых клетках требует детального исследования функциональных и биофизических свойств, как самого I3, так и каналов, регуляция активности которых связана с I3. Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании особенностей отдельных этапов передачи кальциевого сигнала в клетке через рецептор инозитол1,4,5трисфосфата I3 мембраны эндоплазматического ретикулума.