Влияние минисателлитной ДНК на частоту гомологичной рекомбинации ДНК в соматических клетках в культуре

• Автор: Марченко, Борис Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 92 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 I енетическая рекомбинация в эукариотических

клетках.

1.1.1 Модели гомологичной рекомбинации

1.1.2 Особенности гомологичной рекомбинации в соматических клетках.

1.1.3 Горячие точки рекомбинации.

1.2 I 1о вторя ющиеся последовательности в геномах

эукариот. Минисателлиты
1.3 Мутации в минисателлитах
.
1.3.1 Современные пддХоды к выявлению мутаций.
1.3.2 Внутрилокусные мутации в минисателлитах
1.3.3 Модели возникновения внутрилокусных мутаций в минисателлитах.
1.4 Биологическая роль минисателлитов.
1.5 Рекомбинация в прилегающих к минисателлитным
локусам районах уникальной ДНК.
Глава 2. Материалы и методы.
2.1 Бактериальные штаммы и трансформация бактерий
2.2 Генноинженерная техника
2.3 Минисателлитная ДНК.
2.4 Плазмиды
2.5 Клеточные культуры и трансфекция соматических
клеток.
2.6 Получение препаратов ДНК
2.7 Детекция продуктов рекомбинации методом
полимеразной цепной реакции ГЩР
2.8 Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты.
3.1 Конструирование тестерных плазмид.
3.2 Выбор клеточной линии и метода трансфекции
3.3 Измерение частот экстрахромосомной межплазмидной
рекомбинации в экспериментах по постоянной трансформации клеточных культур
3.4 Подтверждение восстановления полноразмерного гена
пео в клеточных клонах, устойчивых к , полимеразной цепной реакцией.
3.5 Измерение отношений числа копий различных
фрагментов гена пео в геномной ДНК трансформированных клеток, устойчивых к антибиотику С8.
3.6 Изменения длины СУКфрагмента ПЦР со специфическими праймерами в геномной ДНК клеток, устойчивых к антибиотику .
Глава 4. Обсуждение
Список литературы


Минисателлитами называют геномные локусы, образованные прямыми повторами ДНК, с длиной повторяющейся последовательности 60 п. iпоследователыюстью сигналом общей рекомбинации в клетках Е. Н iподобный сайт . Характерной особенностью минисателлитов является высокая частота мутаций, изменяющих число повторов в локусе гипервариабильность, что делает их уникальными по информативности генетическими маркерами при картировании генома программа Геном человека, анализе родословных и в судебной медицине. Определенные мутации в некоторых минисателлитах ассоциированы с раком и наследственными болезнями Марченко, Подгорная, i, . Мутационная нестабильность минисателлитов основана на повышенной частоте гомологичной рекомбинации. Предполагается, что рекомбиногенная активность минисателлитов может затрагивать прилегающие к ним районы уникальной ДНК, где может происходить индукция гомологичной рекомбинации , а , , . Это предположение было подтверждено для минисателлитов, которые имеют iподобные сайты. i, , . По соседству с геном устойчивости в плазмиды были встроены минисателлитные последовательности, рекомбиногенная активность которых оценивалась по изменению частоты появления клонов клеток, устойчивых к селективному агенту. В таких экспериментах было показано, что присутствие в плазмидах минисателлита с iподобными сайтами повышает частоту восстановления гена селективной устойчивости . Оставался открытым вопрос, изменяется ли частота рекомбинации в районах уникальной ДНК, прилегающих к минисателлитам без iподобных сайтов. Цель настоящей работы была сформулирована д. .. Глебовым ЦИН РАН, I. i. i, изучение влияния минисатсллитной ДНК без iподобных сайтов на частоту гомологичной рекомбинации в прилежащих районах уникальной ДНК. В качестве минисателлитного фрагмента была выбрана клонированная последовательность V i Vi i v, . Исследуемая последовательность V образована двумя различными минисателлитами аро и без iподобных сайтов, образующими устойчивую пару в геномах различных организмов. Тестерныс плазмиды конструировали на основе челночного вектора V2. Рекомбинацию оценивали по частоте восстановления селективного гена пео из дефектных копий с неперекрывающимися делециями. Сконструировать тестерные плазмиды для оценки рекомбиногенной активности ранее не исследованных минисателли гных ДНК без iподобных сайтов. Определить с помощью сконструированных плазмид рекомбиногенную активность минисателлитов в различных клеточных линиях и отобрать те, в которых эта активность максимальна. В результате предварительных исследований была отобрана клеточная линия трансформированные легочные фибробласты мыши. С помощью ПЦР выявить рекомбинантные продукты в клетках устойчивых к антибиотику клонов и провести их анализ. Согласно данным, полученным для минисателлита с iподобными сайтами, наличие минисателлитной вставки хотя бы в одной из рекомбинирующих плазмид повышает частоту восстановления тестерного гена, а в случае, когда минисателлитная последовательность находится в обеих рекомбинирующих плазмидах, частота восстановления тестерного гена еще выше . Основным механизмом восстановления тестерного гена был признан соматический кроссинговер далее в тексте кроссинговер. ЦР анализе использовали геномную ДНК всей популяции 8устойчивых клеток, полученных в результате одного эксперимента. Впервые описан асимметричный эффект присутствия минисателлитной вставки без iподобных сайтов в одной из рекомбинирующих плазмид, проявляющийся в падении или повышении числа устойчивых к антибиотику клонов, в зависимости от комбинации плазмид при котрансфекции. Результаты указывают на возможную роль генной конверсии в формировании продуктов рекомбинации. , , , однако до сих пор отсутствовали подобные данные для соматических клеток, как нормальных, так и опухолевых , , . Глава 1.