Преждевременное старение и радиочувствительность клеток у больных атаксией-телеангиэктазией

• Автор: Полуботко, Евгения Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 115 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.Роль апоптоза

1.2.Молекулярногенетические механизмы возникновения

1.3.Механизмы активации чекпойнтов и белков, вовлеченных в

разные стадии процесса репарации

1.4.Атаксиятелеангиэктазия. Белок АТМ

1.5.Маркер двунитевых разрывов. Фосфорилированный гистон

1.6.Эпигенетические маркеры старения в

клетках.
1.7.Роль белка Р и его субстратов в репарации
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.Клеточные линии и их культивирование.
2.2.Иммунофлуорссцснтный анализ.
2.3.Метод ДНК комет
2.4.Микроскопия и анализ изображений
2.5.Метод проточной цитометрии
2.6.Статистическая обработка результатов исследования
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 .Определение гетерохроматинового маркера ИР 1 у.
3.2.Выявление эпигенетического маркера МеЗНЗК.
3.3.Выявление эпигенетического маркера МеЗНЗК9
ЗАВыявление фосфорилированой формы гистона Н2АХ.
3.5.Определение количества белка ВР1
3.6.Оценка репаративной способности клеток методом ДНК
3.7.0пределение рапсч1 ингибитора циклинзависимых
3.8. Анализ клеточного цикла методом проточной
цитометрии
ГЛАВА 4.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


При наличии мутаций в обеих аллелях гена развивается тяжелое заболевание со сложным ллейотропным фенотипом атаксиятелеангиэктазия АТ, или синдром ЛуиБар, характеризующееся множественными нейрологическими аномалиями, высокой предрасположен н остыо к опухолевым заболеваниям, ускоренным старением и крайней чувствительностью к действию ионизирующей радиации Спивак, , i, vi, . При отсутствии ее функции частично берег на себя xiii , сходная с ней по структуре, но хуже изученная, так как нокаутные по этому гену мыши гибнут в эмбриогенезе , . Только в году было показано, что нарушение репарации ДНК у больных с синдромом Секеля, характеризующегося, как и АТ, повышенной чувствительностью к ионизирующей радиации, связано с мутацией, инактивирующей ген . Ген находится на хромосоме 1 , имеет размер примерно 0 т. i . i . . Хотя к настоящему времени он полностью секвенирован, оказалось, что каждая детально исследованная АТсемья несет свою собственную мутацию, что требует полного сиквенса исследуемого гена и существенно осложняет диагностику v . Несмотря па имеющиеся к настоящему времени многочисленные данные о роли белка в клеточном ответе на радиационные повреждения, остается недостаточно ясной картина в каждом отдельном случае, с которым сталкиваются клиницисты и ученые. . i . Носители, как правило, имеют предрасположенность к развитию ранних опухолей различной этиологии. Действие небольших случайных доз ионизирующей радиации или мутагенов может служить в таких случаях триггером для развития опухолевого процесса. Поиск быстрого метода определения потенциального носительства мутаций в генах, отвечающих за процессы репарации ДНК в клетке, является, таким образом, одной из важных научнопрактических задач радиобиологии и радиационной гигиены. К настоящему времени накоплен необходимо ремоделирование хроматина, которое происходит при строго ассоциированном с образованием специфическом фосфорилировании Скоицевого серима9 вариантного гистона Н2АХ . i . , , . Мегабазные участки хроматина, покрывающие , можно легко визуализировать в ядрах или экстрактах облученных клеток как фокусы фосфорилированного по серину9 гистона И2АХ названного уН2АХ с помощью специфических антител на фосфорилированный короткий пептид, соответствующий Сконцу 1I2X. Эти фокусы могут служить маркерами и способствовать изучению их индукции и процессинга , , . В клетках высших эукариот гистон И2АХ фосфорилируется протеиикиназой в первые же минуты после образования , и инактивация приводит к нарушению этого фосфорилирования. Но в радиочувствительных клетках больных АТ, дефектных по киназе , фокусы уН2АХ после облучения все же выявляются. ДНК, так как в остановившихся в местах повреждения ДНК репликативных вилках фосфорилирование гистона Н2АХ проводит другая протеинкиназа , но не i . Еще одной прямой мишенью является белок Р, фосфорилируемый ею по серину в положении. Это фосфорилирование приводит к высвобождению Р из комплекса с 2 который также фосфорилирует по серину в положении 5 и его стабилизации и накоплению в ядре. Благодаря стабилизации белка Р и его последующей относительно более медленной работе как фактора транскрипции, включающего синтез соответствующих белков, например белка Р, в клетке генерируется длительный и глубокий 1арест, опосредуемый инактивацией комплекса циклин 2 . Другой важнейший фактор транскрипции, играющий ключевую роль в контроле клеточного цикла белок 21 также фосфорилируется и стабилизурутся зависимым способом i . В тоже время давно показана и многократно подтверждена независимыми исследователями радиорезистентность клеточного цикла в клетках больных . Спорным остается вопрос о том, как изменятся параметры клеточного цикла в клетках гетерозиготных носителей АТ и будет ли другим характер формирования в них чекпойнтов в ответ на повреждение ДНК.