Тандемные повторы генома мыши и их вклад в структуру хромоцентров

• Автор: Кузнецова, Инна Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Цели и задачи исследования

Основные положения выносимые на защиту

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Организация генома эукариот

1.2. Особенности структуры сателлитноГ. ДНК

1.3. Организация короткого плеча хромосом мыши

1.4. Рольтсломср в репликации эукариотических хромосом

1.5. Пространственное расположение центромерных и теломерных районов хромосом в интерфазных ядрах

1.6. Гстсрохроматин и эффект положения

1.7. Эпигенетические механизмы формирования гетерохроматина

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Плазмиды
2.2. Выделение плазмидной Д 1К, электрофорез ДК
2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
2.4. Культивирование клегок
2.5. Получение препаратов метафазных хромосом
2.6. Клеточная синхронизация, проточная цитофлюоромстрия
2.7. Получение митотических хромосом из овулировавших ооцитов
2.8. Выделение ядер печени мыши
2.9. Выделение геномной ДНК мыши
2 Выявление сайтов репликации
2 Клонирование фрагментов ДНК фракции хромоцентров
2 Секвинирование
2 Полимсрзная цепная реакция
2 Получение меченых фрагментов ДНК
2 Компьютерный анализ клонированных последовательностей
2 Определение величины изгиба фрагментов ДНК
2 Гибридизация на фильтрах
2 Флюоресцентная гибридизация i i I
2 Олигомечение i i со специфичными праймерами I
2 Флюоресцентная и конфокальня микроскопия
2 Другие методы исследования
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Определение локализации центромерных и теломерных районов хромосом в интерфазных ядрах клеток в культуре
3.1.1. Синхронизация клеточной культуры
3.1.2. Морфология хромоцентров
3.1.3. Локализация минорного, мажорного сателлита и теломер на метафазных хромосомах клеток культуры
3.1.4. Распределение минорного, мажорного сателлита в интерфазных ядрах клеток культуры 9 в течение клеточного цикла
3.1.5. Локализация теломерной последовательности в интерфазных ядрах клеток культу ры 9 в течение клеточного цикла
3.1.6. Локализация теломерной последовательности хромосом относительно минорного и мажорного сателлита в и фазах клеточного цикла
3.2. Исследование структуры и локализации последовательностей 3 и 4 выделенных из фракции ДНК хромоцентров мыши
3.2.1. Структура первичной последовательности 3 и
3.2.2. Анализ геномной организации 3 и 4 методом гибридизации по Саузерну и полимеразной цепной реакции
3.2.3. Оценка содержания 3 и 4 в геноме мыши
3.2.4. Сравнение степени изогнутости фрагментов сателлитных ДНК и их возможность формировать структуры подобные
3.2.5. бокс в последовательностях 3 и
3.2.6. Локализация 3 и 4 в интерфазных ядрах и метафазных хромосомах клеток линии
3.2.7. Локализация фрагментов сателлитной ДНК в ядрах печени мыши
3.2.8. Определение положение последовательностей М и минорного
саттсллита на препаратах преждевременно конденсированных хромосом
Глава 4. ОБСУЖДЕ1ШБ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


При формировании архитектуры ядра центромерные и прицентромерные районы различных хромосом действуют как структурные центры для конденсации и дскондснсации хроматина ii, , . Показана агрегация центромерных районов как гомологичных, так и нсгомологичпых хромосом человека i . Гольдман и др. Гетерохроматиновые участки хромосом ассоциируют между собой специфичным для каждого типа клеток образом, образуя в интерфазных ядрах дискретные регионы хромоцентры, сохраняющие свое конденсированное состояние в течение всей интерфазы . Хромоцентры можно наблюдать как оптически плотные структуры Куличков, Жимулев, ПрокофьеваБельговская, или как I 4, 6диамидино2фснилиндол позитивные домены , , . ПрокофьеваБельговская, . Хромоцентры являются динамичными структурами, их размеры и число видо и тканеспецифичны и изменяются в течение клеточного цикла и при дифферениировкс . Методом электронной микроскопии показано, что хромоцентры контактируют с ядерной оболочкой и ядрышком i, . Данные структуры являются элементами ядерного матрикса и, следовательно, в составе хромоцентров можно ожидать элементы хроматинового скелета. Хромосома имеет специфические участки закрепления на ядерной оболочке. Эту функцию в ядрах клеток мыши наряду с теломерным районом хромосом могут выполнять прицентромерные районы. Прицснтромерный район хромосом мыши состоит из массива мажорного сателлита маСат и имеет более плотную укладку, чем хроматин плеч хромосом, и менее плотную укладку относительно хроматина минорного сателлита миСат i, , , локализованного непосредственно в области первичной перетяжки хромосом. Необходимо отметить, что хромосомы мыши являются а кро центрическим и, их короткое плечо состоит из центромерной, субтеломсрной и теломерной последовательностей ДИК. При исследовании динамики и структуры хромоцентров различные авторы определяют их как структуры, ярко окрашенные I, либо как конгломераты центромерных последовательностей i . В составе хромоцентров были обнаружены белкисайленсеры транскрипции и белки, взаимодействующие с некодирующими последовательностями ДНК 2, v . Барсукова и др. НР1 . Определения хромоцентров, существующие в литературе, свидетельствуют о том, что ни последовательности ДНК, входящие в них, ни белковый состав хромоцентров не описаны комплексно. В литературе нет исчерпывающего исследования положения клонированных тандемных повторов мыши по отношению к хромоцентрам на разных стадиях клеточного цикла. Препарат хромоцентров, полученный в результате недавно разработанного метода Прусов, Зацепина, был использован для клонирования входящую в него ДНК. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось как изучение вовлеченности известных клонированных сатДНК мыши и теломерной последовательности в структуру хромоцентров, так и поиск других последовательностей, входящих в состав хромоцентров ядер клеток . Определить положение центромерных миСат, прицентромериых маСат сатДНК и теломерной Тел последовательности i си по отношению к хромоцентрам на разных стадиях клеточного цикла в синхронизированной культуре клеток мышиных фибробластов 9. Клонировать фрагменты выделенной ДНК хромоцентров мыши. Определить нуклеотидную последовательность отобранных клонированных фрагментов. Произвести поиск в базах данных последовательностей, гомологичных выделенным. Охарактеризовать клонированные последовательности ДИК хромоцентров. Определить локализацию клонированных фрагментов ДНК хромоцентров мыши на мстафазных хромосомах и в интерфазных ядрах. Основные положения, выносимые на защиту. Центромерные, прицентромерные и теломерные районы хромосом меняют свое положение в течение клеточного цикла, входят в состав хромоцентров, однако не являются их основной составляющей. Клонированные последовательности ДНК хромоцентров 3 и 4, локализованные в центромерном районе хромосом, являются новым типом сатДНК обогащенной нуклеотидами. Их количество в геноме составляет 2,2 и 1,6 соответственно. Суммарный сигнал всех сатДНК маСат, миСат, 3 и 4 полноегью не покрывает всю область хромоцентров.