Активность и теплоустойчивость некоторых ферментов amoeba proteus при изменении температуры культивирования амеб

• Автор: Подлипаева, Юлия Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оглавление 2

Введение

1 .Обзор литературы 6

Л.Биохимические изменения при смене температурного режима 7

1.1.1. Теплоустойчивость белков

1.1.2. Количественный способ регуляции работы ферментов при изменении температуры среды
1.1.3. Изменение каталитической эффективности ферментов при смене температурного режима

1.2. Влияние температуры среды на одноклеточные организмы

1.2.1. Теплоустойчивость простейших

1.2.2. Биохимические особенности реакции одноклеточных организмов

на изменение температурного режима
2. Цель и задачи исследования
3. Материал и методика
3.1. Амебы объект исследования
3.1.1. Происхождение амеб, использованных в работе
3.1.2. Культивирование амеб
3.2. Гомогенат и супернатант
3.2.1. Получение гомогената
3.2.2. Получение супернатанта
3.3. Определение активности ферментов
3.3.1. Определение активности суммарных водорастворимых эстераз
3.3.2. Определение активности ферментов фосфоглюконатного пути
3.4. Определение теплоустойчивости ферментов
3.4.1. Определение теплоустойчивости суммарных водорастворимых эстераз
3.4.2. Определение теплоустойчивости глкжозо6фосфатдегидро
геназы Г6ФДГ
3.4.3. Статистическая обработка данных
3.5. Анализ электрофоретических форм ферментов
3.5.1. Проведение нативного электрофореза
3.5.2. Обработка гелей после электрофореза
3.6. Выявление белков теплового шока у амеб
3.6.1. Воздействие тепловым шоком и получение гомогената и супернатанта
3.6.2.Проведение8электрофореза
3.6.3.Иммуноблоттинг
3.6.4. Очистка белка
4. Результаты и обсуждение
4.1. Суммарные водорастворимые эстеразы СВЭ
4.1.1. Активность и теплоустойчивость СВЭ у двух штаммов амеб, культивируемых при С
4.1.2. Активность и теплоустойчивость СВЭ у амеб, аккпимированных
к пониженной температуре С
4.2. Глюкозо6фосфатдегидрогеназа Г6ФДГ
4.2.1. Активность Г6ФДГ у амеб и особенности ее определения методами спектрофотометрии и электрофореза в ПААТ
4.2.2. Теплоустойчивость водорастворимой Г6ФДГ двух штаммов амеб, культивируемых при С
4.2.3. Активность Г6ФДГ у амеб, аккпимированных к относительно низкой температуре С
4.2.4. Теплоустойчивость Г6ФДГ амеб штамма , аккпимированных к С
4.2.5. Теплоустойчивость Г6ФДГ амеб штамма , акклимированных к повышенной температуре С
4.3. Ьелок теплового шока семейства II у амеб штамма 5
4.3.1. Выявление белка методом иммуноблоттинга
4.3.2. Выделение белка методом хроматографии
Выводы
Список литературы


Различный уровень теплоустойчивости клеток, характерный для каждого вида, возник и закрепился в процессе эволюции и является, по мнению Б. П. Ушакова, одним из критериев вида v, . По результатам многих исследований был сформулирован вывод о том, что в природеимеет место соответствие между температурной экологией вида и теплоустойчивостью клеток организма Александров, , стр. Что же касается модификационных изменений теплоустойчивости клеток в процессе акклимации организма к изменяющимся температурным условиям, то, за некоторыми исключениями Камшилов, Дрегольская, , у большинства многоклеточных организмов изменения окружающей температуры, не выходящие за пределы их ДТ, не вызывают сдвигов в уровне теплоустойчивости их клеток. Таким образом, клетки многоклеточного организма обладают более низкой акклимационной подвижностью, чем организм в целом Ушаков, . Супероптимальный нагрев может способствовать возникновению временной термотолерантности повышению теплоустойчивости клеток 1л, . Наряду с фактами, говорящими о том, что в приобретении клетками такой повышенной теплоустойчивости участвуют НБР Копке1 а МсКесЬт е НБР в процессе повышения терморезистентности клеток после гипертермии НаЬе, НаЬег, . В. Я. Александров и И. М. Кислюк в обзоре, посвященном физиологическому аспекту реакции клеток на тепловой шок, делают заключение, что вопрос о механизме реактивного повышения теплоустойчивости клеточных функций и белков при тепловом шоке пока остается без ответа Александров, Кислюк, . Особенно зависимы от колебаний температуры эктотермные пойкилотермные организмы, температура тела которых непостоянна и близка к температуре окружающей среды. Хочачка, Сомеро, . Для эктотермных животных характерны два типа, или, точнее, уровня регуляции в ответ на колебания температуры. Первый это поведенческий, направленный на то, чтобы при кратковременных колебаниях температуры среды найти подходящую микросреду для поддержания температуры тела, близкой к оптимальной. Регуляция второго уровня связана с адаптациями биохимических систем организма при длительных, например сезонных, колебаниях температуры. В основе компенсации температурных влияний на обмен лежат количественный и качественный способы регуляции работы ферментов. Первый способ это изменение содержания ферментов в клетках. Второй способ, направленный на коррекцию каталитической эффективности ферментов, включает в себя конформационные изменения белковферментов, поддержание постоянства константы Михаэлиса для субстратов и кофакторов и выработку различных изо и аллоформ фермента, более пригодных для функционирования в соответствующих температурных условиях Хочачка, Сомеро, . Показателем того, состоялись или нет адаптивные процессы, принято считать также изменение теплоустойчивости белков, в частности, белковферментов. Кроме того, будет сделана попытка проанализировать особенности температурных приспособлений одноклеточных организмов простейших в терминах, обозначенных выше. Биохимические изменения при смене температурного режима. Теплоустойчивость белков. Первичная теплоустойчивость клетки или какойлибо клеточной функции коррелирует с теплоустойчивостью связанных с этой функцией белков Александров, . Было показано, что у видов, живущих в более теплом климате, теплоустойчивость многих клеточных функций и белков выше, чем у родственных видов из холодных мест обитания Ушаков и др. , . Результаты изучения разнообразных ферментных систем показали, что близкородственные виды эктотермных животных обладают разной теплоустойчивостью белковых комплексов в зависимости от температуры их обитания и что, как правило, наблюдается соответствие теплоустойчивости ферментов остаточной ферментативной активности после прогрева при тестирующих температурах теплолюбивости вида животного Виноградова, Глушанкова, Кусакина, . ii . Фельдман, Каменцева, , . У бактерий также была обнаружена связь между температурой обитания вида и уровнем термостабильности белков.