Влияние лизосомотропных соединений на функциональную активность лизосомного аппарата клетки

• Автор: Леонтьева, Екатерина Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 166 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Эндоцитоз

2.2 Лизосомы

2.3 Слияние мембран в клетке

2.4 Слияние фагосом с лизосомами. Ингибиторы и стимуляторы слияния

2.5 Цитоскелет в процессе эндоцитоза

2 6 Роль лизосом в процессе трансфекции

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Клеточные культуры

3 2 Подготовка гомогенатов клеток для определения активности ферментов

3 3 Субклеточное фракционирование в градиенте плотности сахарозы
3 4 Получение очищенной фракции лизосом из печени крыс
3 5 Определение активности ферментов лизосом
3 6 Определение концентрации белка
3.7 Методика исследования слияния фагосом с лизосомами
3 8 Определение содержания Фактина в перитонеальных макрофагах мыши 3 9 Исследование изменений параметров лизосомных мембран с помощью флуоресцентных зондов
3 Проведение экспериментов по трансфекции
3. Конфокальная микроскопия
3. Методика исследования цитотоксичности
4 РЕЗУЛЬТАТЫ 4 1 Динамика поступления веществ в фибробласты,
их распределение и локализация
4 1.1 Сангвинарин
4.1.2 Хелеритрин
4 2 Влияние сангвинарина на активность лизосомных ферментов
фибробластов мыши сублинии ЬБМ
4 3 Влияние хелеритрина на активность лизосомных ферментов
мыши сублинии ЬБМ
4.4 Действие сангвинарина на активность маркерных ферментов лизосом
4.5 Действие ларахлормеркурибензойной кислоты на активность маркерных ферментов лизосом
4 6 Действие Уэтилмалеимида на активность маркерных ферментов лизосом
4.7 Влияние дитиотреитола на активность маркерных ферментов лизосом 4 8 Влияние билирубина, фарморубицина и хелеритрина на СЛФ в перитонеальных макрофагах мыши
4.9 Влияние билирубина, фарморубицина и хелеритрина на содержание Фактина в перитонеальных макрофагах мыши
4. Влияние билирубина, фарморубицина и хелеритрина на состояние мембраны лизосом гепатоцитов мыши
4. Влияние различных катионных векторов на эффективность экспрессии плазмидной ДНК рСМУ1ис
4. Влияние катионных векторов в комплексе с плазмидной ДНК на слияние
лизосом с фагосомами в перитонеальных макрофагах мыши и в макрофагах линии
4. Цитотоксические эффекты поликатионных векторов отдельно и в комплексе с плазмидной ДНК
4 Действие декстран сульфата и сурамина на эффективность трансфекции плазмидной ДНК рСМУ1ис в комплексе с катионными векторами
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПО
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
А
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БАС биологически активные соединения Г АЛ галактозидаза ДФГТ 1,6дифенил 1,3,5гексатриен ДТТ дитиотреитол
ДОТАП 1,2диолеилЗтриметиламмонийпропан
КФ кислая фосфатаза
МФ микрофиламенты
МТ микротрубочки
ПА полиаргинин
ПДЛ полиЭлизин
ПЛЛ полиЬлизин
ПФ промежуточные филаменты
ПЭИ полиэтилен им ин
СЛФ слияние фагосом с лизосомами
ТМАДФГТ триметиламинофенил1,3,5гексатриен
ЦС цитоскелет
ХМБК парахлормеркурибензойная кислота
i
АГА ацетил,.глюкозаминидаза
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Данные о механизме рецепторопосредованного эндоцитоза были получены, в основном, при использовании в качестве лигандов различных белков плазмы трансферрин, асиалогликопротеины, липопротеины низкой плотности и др. Никольский и др. При рецепторопосрсдованном эндоцитозе рецепторы, в основном, концентрируются на специфических участках плазматической мембраны окаймленных ямках, образуя скопления кластеры. Впервые окаймленные клатрином ямки и пузырьки были обнаружены более лет назад Ротом и Портером при изучении поглощения белков желтка ооцитами москитов. Авторы предположили, что через окаймленные ямки осуществляется селективное поглощение внеклеточного материала не только в ооцитах, но и в других типах клеток В соответствии с этой гипотезой, окаймление выполняет как механическую роль при образовании окаймленных ямок и везикул, так и обеспечивает селективность адсорбируемых лигандов , , . Количество окаймленных ямок различно в зависимости от типа клеток, в среднем оно составляет около 2 от поверхности плазматической мембраны , . Схема 1 Общая схема эндоцитозного пути в неполяризованной клетке по д а. СР окаймленные ямки, СУ окаймленные пу зырьки. БЕ сортирующие эндосомы. И С рециклиру ющие эндосомы, ядро. ТОМ сеть трансГольджи. МУВ мульти везикулярные тела, ЬВ поздние эндосомы, ЬУ лнзосомы, Т компоненты слатрина. Методы очистки и выделения окаймленных пузырьков позволили установить, что основной составляющей окаймления является белок клатрин Реагве, . Клатрин образует структуру в виде решетки на цитоплазматической поверхности окаймленных ямок. Да, образующих трискелион основную структурную единицу клатриновой решетки i , . Тяжелые цепи формируют каркас клатриновой решетки, роль легких цепей до конца не выяснена. Сборка клатрина на окаймленных ямках происходит вслед за присоединением комплекса белков, называемых АР2 адапторами. Адапторные комплексы связываются с цитоплазматическими доменами таких мембранных рецепторов как рецепторы липопротеина низкой плотности ЛНП, трансферрина, асиалогликопротеина и эпидермального фактора роста ЭФР, и способствуют их концентрации в окаймленных ямках i , , i, i, . Окаймленные клатриновые пузырьки образуются и в секреторном пути после присоединения второго адапторного комплекса АР1 к комплексу Гольджи. Они осуществляют транспорт вновь синтезированных лизосомных компонентов в эндосомы. Существует также два других типа комплексов окаймления, которые опосредуют транспорт молекул между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи i . После отделения от плазматической мембраны пузырьки с клатриновым окаймлением перемещаются от периферии к центру клетки В этом процессе участвуют элементы цитоскелета окаймленные пузырьки транспортируются вдоль микротрубочек к перинуклеарным эндосомам, с которыми они сливаются , ivi, . Отделение клатримовой оболочки необходимо для последующего слияния с эндосомами. Этот процесс происходит при участии специфической АТФазы i i , относящейся к семейству белковшаперонов i, Комплексы рецепторов с лигандами, интернализованные в процессе эндоцитоза, доставляются в эндосомы, где они сортируются В основном, комплексы диссоциируют в ранних эндосомах лиганды передаются в поздние эндосомы и л изосомы, а рецепторы рециклируют в плазматическую мембрану , , , i . В связи с этой функцией ранние эндосомы были также названы сортирующими . Большая часть таких рецепторов, как рецептор трансферрина, возвращается к поверхности клетки через очень короткое время. Оставшаяся фракция аккумулируется в мембранных трубчатых структурах, расположенных вблизи центра организации микротрубочек Поскольку, эти органеллы получают материал, не предназначенный для попадания в поздние эндосомы и л изосомы, а их несколько выше, чем ранних эндосом, то они были определены как отдельная популяция эндосом рециклирующие эндосомы i, , i , В то время считалось, что его функция ограничивается лишь аккумуляцией и хранением рециклирующих в плазматическую мембрану рецепторов. Дальнейшие исследования показали, что рециклирующие эндосомы играют значительно более сложную роль во внутриклеточных транспортных процессах , .