Агробактериальная трансформация эмбрионов морских ежей и нарушение хода эмбриогенеза при экспрессии растительных онкогенов rolB и rolC

• Автор: Яковлев, Константин Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Перенос генетического материала у прокариот.

1.2 Агробактериальный перенос ДНК.

1.2.1 Распознавание растительной клеткиреципиента

i 1.2.2 Трансформация и ядерный транспорт ТДНК.

1.2.3. Биологическое значение агробактериальной трансформации.

1.3. Горизонтальный перенос генов от прокариот в эукариотические клетки, возможно, имеет эволюционное значение.

1.4. Эмбриональное развитие морских ежей

1.4.1. Бластуляция морских ежей.
1.4.2. Процесс гаструляции
1.4.3. Появление и развитие мезенхимного паттерна.
1.4.4. Клеточные взаимодействия, определяющие дифферепциропку и развитие
1.4.5. Молекулярная регуляция событий, происходящих на ранних эмбриональных стадиях.
1.4.6. Использование универсального активатора транскрипции дрожжей гена 4.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
2.1. Животные.
2.2. Трансформация оплодотворенных яйцеклеток.
2.2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2.2. Выделение плазмиды.
2.2.3. Трансформация плазмидой, содержащей ген универсального активатора транскрипции
2.2.4. Агробактериальная трансформация эмбрионов
2.3. Измерение числа агробактерий в ходе совместного культивирования с
эмбрионами морских ежей.
2.4. Измерение i морской воды в ходе совместного культивирования агробактсрий и эмбрионов морских ежей.
2.5. Световая и трансмиссионная электронная микроскопия.
2.6. ДНК и РНКанализ
2.6.1. ПЦР и ОТ ПЦР.
2.6.2. 1 ПЦР.
2.6.3. Клонирование и секвенирование
2.7. Выявление включения 5бромо2дезоксиуридина в эмбрионах морских ежей
2.7. Статистический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Жизнеспособность агробактерий в морской воде.
3.2. Прикрепление агробактсрий к клеткам эмбрионов морских ежей
3.3.1. Наличие и экспрессия генов i в трансформированных эмбрионах
3.3.2. Доказательство встройки ТДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей
3.4. Появление и возможные причины формирования опухолеподобных структур ОПС у эмбрионов морских ежей.
3.4.1. Процент ОПС при трансформации геном 4 и растительными онкогенами и
3.4.2. Уменьшение числа ОПС при использовании конструкций, несущих мутантные гены v
3.4.3. Изменение морской воды в ходе совместного культивирования агробактерий и эмбрионов морских ежей.
3.5. Строение эмбрионов с опухолеподобными структурами
3.5.1. Внешний вид эмбрионов с опухолеподобными структурами.
3.5.2. Строение и ультраструктура эмбрионов с ОПС.
3.5.2.1 Строение и структура эмбрионов, трансформированных плазмидой рМА3 .
3.5.2.2 Строение и структура эмбрионов с ОПС после агробакгериальной трансформации.
3.5.2.3 Включение 5бромо2дезоксиуридина в эмбрионах с ОПС после
а1робакч ериальной трансформации
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Жизнеспособность и способность к трансформации i итеааепз в морской воде
4.2. Встройка ТДНК агробактерий и экспрессия генов го1В и го1С при совместном культивировании с эмбрионами морских ежей
4.3. Появление опухолеподобных структур у эмбрионов обусловлено переносом ТДНК агробактерий
4.4. Возможное влияние изменения морской воды при совместном культивировании А. ШтеаЫепя и эмбрионов морских ежей.
4.5. Опухолеподобные струкгуры эмбрионов морских ежей строение и возможные причины возникновения в результате изменения нормального хода эмбриогенеза
4.5.1. Внешний вид и строение опухолеподобных структур
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АХ архентсрон БДУ 5бромо2дезоксиуридин ВМЗ вторичная мезенхима к ДНК кошлементарная ДНК М3 мезенхима
ОПС опухолеподобная структура
ПМЗ первичная мезенхима
ПЭГ полиэтиленгликоль
ТДНК переносимая ДНК
ТФР ростовой фактор тромбоцитов
ФИТЦ флюоресцеина изотиоционат
ФРФ фактор роста фибробластов
ЭФР эпидермальный фактор роста
этилендиаминтетрауксусная кислота
МАРкиназа протеинкиназа, активируемая митогенами
фосфатный буфер
додецилсульфат натрия
ТВЕ буфер на основе Триса и борной кислоты с добавлением ТЕМ трансмиссионная электронная микроскопия вышележащая активирующая последовательность
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В ходе эволюции бактерии рода i в соответствии с новой классификацией большинство видов реклассифицированов род ii, однако большинство ученых, изучающих агробакгериальную трансформацию растительных клеток, используют старое название приспособились к переходу от сапротрофного типа питания к своеобразному паразитическому типу путем переноса в растительные клетки генов синтеза опинов продуктов реакции кетосахаров и аминокислот и генов, вызывающих неопластическую трансформацию клеток растений. В результате такой трансформации у растений появляются быстро делящиеся клетки, синтезирующие опины, которые служат для агробактерий источником углерода и азота. Агробактериальная трансформация нашла широкое применение в генной инженерии растений и на сегодняшний день относится к наиболее распространенным методам генетической трансформации растений. Наличие у ряда представителей некоторых групп морских беспозвоночных кольчатые черви, моллюски, ракообразные, иглокожие ферментов опинового синтеза позволило сделать предположение о возможном переносе генов опинсинтетаз от агробактерий к морским беспозвоночным. Долгое время вопрос о возможной агробактериальной трансформации животных клеток оставался открытым, пока в году не было показано на культуре клеток человека , что агробактерии могут трансформировать клетки млекопитающих i . Несколькими годами ранее было показано, что агробактерии могут трансформировать клетки грибов , , i . На сегодняшний день известно, активация генов под контролем растительных промоторов и в животных клетках возможна благодаря распознаванию их регуляторными элементами клеткиреципиента . Эти промоторы имеют либо вирусную природу , вирус мозаики цветной капусты, либо агробактериальную , бактерии рода i. Однако информации о функционировании регуляторных генов растений в клетках животных нет. Это особенно касается функционирования растительных онкогенов i в связи с возможностью агробактериальной трансформации клеток животных. В наших экспериментах мы показали, что в условиях морской среды i vi может происходить агробактериальная трансформация при совместном культивировании эмбрионов морских ежей с агробактериями i i ii i, которые несут растительные онкогены и . У части эмбрионов нарушается ход эмбриогенеза с образованием опухолеподобных структур ОПС. Такие структуры формируются на поверхности эмбрионов и получили свое название изза внешнего вида. Подобное нарушение эмбриогенеза было описано ранее после трансформации генетическими конструкциями, несущими ген универсального активатора транскрипции 4 v . В наших исследованиях мы изучали строение эмбрионов с опухолеподобными структурами после трансформации плазмидной ДНК, несущей ген 4, и после агробактериальной трансформации генами и . Это позволило выявить различия в строении эмбрионов с опухолеподобными структурами и в строении самих ОПС, а на основании этого установить, что возникновение опухолеподобных структур является следствием действия разных механизмов. При выполнении работы мы преследовали две цели. ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей, доказать встройку чужеродной ДНК и активность перенесенных генов и . Вовторых, изучить влияние растительных онкогенов и на ход эмбриогенеза морских ежей. Подобрать и оптимизировать условия агробактериальной трансформации эмбрионов морских ежей в процессе их совместного культивирования со штаммами . V, которые несут бинарный вектор vVхелперная плазмида и V2, содержащую в составе ТДНК один из генов i или i С. Определить возможные механизмы трансформации. Оценить эффективность агробактериальной трансформации в сравнении с ПЭГюпосредованной трансформацией плазмидными конструкциями, несущими чужеродные гены. Доказать встройку ТДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей, используя методы ЦР и IПЦР. Определить активность генов и методом обратнотранскрипционной полимеразной цепной реакции ОТ ПЦР после совместного культивирования эмбрионов с агробактериями. Провести сравнительный морфологический анализ эмбрионов с опухолеподобными структурами, возникающими вследствие трансформации генетическими конструкциями, несущими ген 4 и гены и . Определить сходство и различие в строении эмбрионов и опухолеподобных структур после трансформации. В нашей работе впервые продемонстрирована возможность агробактериальной трансформации в условиях морской среды на примере эмбрионов морских ежей. Это является подтверждением гипотезы о переносе генов опинового синтеза от агробакгерий к представителям различных групп морских беспозвоночных.