Структурная и функциональная организация реплицируемого хроматина

• Автор: Голышев, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

Содержание.
Введение.

Обзор литературы

Организация интерфазного хроматина

Уровни компактизации хроматина в интерфазе и в митозе.

Комттартментапизация хромосом в интерфазном ядре

Подвижность хроматина

Репликация ДНК процесс, организованный в пространстве и во времени

Дискретность репликации

Локальные изменения структуры хроматина при взаимодействии с

репликациоиным комплексом

Топология, структура и свойства репликационных сайтов
Ультраструктура репликационных сайтов
Преждевременноконденсированные хромосомы моментальный снимок активных
репликационных единиц
Задачи работы
Материалы и Методы.
Используемые сокращения
Культура клеток
Маркирование сайтов репликации и новореплицированиой ДНК.
Индукция преждевременной конденсации хроматина.
Получение хромосомных препаратов.
Стандартная фиксация.
Пермеабилизация клеток.
Получение препаратов стабилизированного ядерпого матрикса
Иммуноцитохимическое выявление БрдУ
Изучение препаратов и регистрация результатов
Электронномикроскопические исследования.
Выявление реплицированной ДНК на ультратопких срезах.
Изучение и обработка электронномикроскопических данных
Результаты
Характеристика клеточных моделей.
Динамика репликационных сайтов в клетках линии СГ1ЭВ, фиксированных п вШ.
Импульсное и отложенное мечение.
Длительное мечение
РС в условиях структурной модификации хроматина
Роль гистонов и негистоновых белков в организации РС.
Репликационные сайты в клетках линии Ь9. Импульсное и отложенное мечение. Оптимизация метода выявления репликационных сайтов на ультраструктурном уровне.
Ультраструктурная организация реплицирующегося хроматина факультативного
гетерохроматина и эухроматина в клетках линии Ь9
Структурная организация реплицирующегося конститутивного гетерохроматина
хромоцентров в клетках линии Ь9
Световая микроскопия
Электронная микроскопия.
Организация реплицирующейся ДНК в дифференциально деконденсировашюм
хроматине
Упаковка хроматина, закончившего репликацию
Зоны репликации в преждевременно конденсированных хромосомах.
Обсуждение результатов.
Методические подходы к изучению ультраструктуры реплицируемого хроматина
Организация тотального хроматина
Реакция репликационных сайтов и реплицированного хроматина на изменения ионных
условий.
Различные конфигурации зон репликации ДНК.
Локализация и конформация хроматина, закончившего репликацию
Репликация хромоцентров.
Модель организации репликационного сайта и структурной организации
реплицируемого хроматина
Список литературы


Наряду с этим продемонстрировано, что активные гены, расположенные в различных сегментах хромосомы, или даже на разных хромосомах, могут сближаться и единовременно транскрибироваться в одних и тех же транскрипционных сайтах . i . , . Эти сайты являются элементами второго высокоуровнего структурного и функционального домена ядра интерхроматинового пространства i . i . i . . , . Этот компартмент весьма разветвлен и не только отделяет хромосомные территории одну от другой, но и глубоко проникает в них, разделяя на субдомены . V . Vi , и др. Таким образом, не только собственно хромосомы, но и интерхромосомное пространство компартментализовано, и протекающие в нем процессы приурочены к определенным структурам i , , ii, . Белковое и РНПнаполнение интерхромосомного пространства в настоящее время отождествляется с ядерным белковым матриксом или кариоскелетом, выявляемым в виде сети филаментов в остаточных ядрах, подвергнутых обработке нуклеазами и агентами, удаляющими гистоны , . Роль ядерного матрикса в организации внутриядерного пространства несомненна, однако статичная, скелетная функция этой структуры отрицается в пользу гипотезы о динамической ассоциациидиссоциации компонентов интерхромосомного пространства друг с другом ii, и с маркерными и функциональными последовательностями ДНК ix i, промоторами, i и другими i . Подвижность хроматина. Как было показано в работе по изучению восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания химерных молекул гистонов, тотальный интерфазный хроматин не демонстрирует какойлибо заметной подвижности в 1 и фазах клеточного цикла . Однако нет оснований считать хроматин статичной системой. Отдельные локусы подвержены коротким i . . . . i . Направленные перемещения сопровождают репликацию минихромосом I ii, ii . i . . Vi . , . V . . . . i . . . Репликация ДНК процесс, организованный в пространстве и во времени. В отличие от остальных геномных процессов, происходящих локально и приуроченных к определенным зонам иили структурам внутри ядра, репликация и сопутствующая ей реорганизация хроматина затрагивает весь геном клетки и при этом проходит в строгой координации с другими процессами и событиями клеточного цикла. Дискретность репликации. Геном высших эукариот состоит из нескольких миллиардов нуклеотидных пар. Средняя скорость работы ДНКполимеразного комплекса составляет примерно одну тысячу пар оснований в минуту Юров и Ляпунова, . В то же время на репликацию ДНК в клеточном цикле отводится около часов. Полная репликация генома за это время возможна благодаря параллельной работе нескольких тысяч репликациошгых комплексов, каждый из которых синтезирует ДНК на отдельном сегменте матричной молекулы. Термин репликон обозначает отрезок молекулы ДНК, реплицируемый отдельно от других сегментов. Он содержит в себе точку инициации ii и реплицируется двумя репликационными комплексами, движущимися в противоположных направлениях от точки инициации. Показано, что функционирование большинства репликонов в составе тотального хроматина завершается в случайных точках, расположенных между двумя фактическими сайтами инициации, при встрече движущихся навстречу друг другу репликационных комплексов Vv . Линейные репликоны представляют собой основу дискретности протекания репликации в эукариотических клетках. Второй уровень дискретной организации репликационных событий был показан методом авторадиографии на расправленных нитях ДНК i i. Этот метод позволил напрямую визуализировать синхронную инициацию и прогрессию элонгации в группах кластерах тандемно расположенных репликонов i, , , .