Миогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro и in vivo

• Автор: Горностаева, Светлана Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки получение и свойства.

1.1.1. Регуляция дифференциации

1.2. Источники мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

1.3. Миогенная дифференцировка ММСК i vi.

1.4. Изучение миогенеза i viv.

1.4.1. Как стволовые клетки становятся кардиомиоцитами. Слияние

или дифференцировка

1.4.2. Кардиомиогенные сигналы дифференциации.

1.4.3. Временной промежуток для оптимальной дифференциации. Глава II. Материалы и методы
II. 1. Выделение мезенхимальных клеток из тимуса, костного мозга, печени и селезенки
.2. Клонирование.
.3. Подсчет колоний.
.4. Иммуноцитохимические исследования.
.5. Анализ иммунофенотипа полученных культур мул ьти потентных
мезенхимальных стромальных клеток.
.6. Функциональная характеристика выделенных культур.
.7. Направленная миогенная дифференцировка 5азацитидином
.8. Моделирование инфаркта миокарда
.9. Приготовление клеточного трансплантата.
Клеточная трансплантация i viv
Приготовление гистологических препаратов
Статистическая обработка данных.
Глава III. Результаты и обсуждение
III. 1. Выделение колоний мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных органов гемопоэза и
иммуногенеза
III. 1.1 Получение культуры мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток из костного мозга
III. 1.2. Выделение культуры мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток из тимуса.
III. 1.3. Выделение мультипотентных мезенхимальных стромальных
клеток из печени.
III. 1.4. Выделение культуры мультипотентных мезенхимальных
стромальных клеток из селезенки.
III.2. Характеристика выделенных культур.
III.2.1. Цитофлюориметрический анализ иммунофенотипа
клеточных культур.
.2.2 Исследование дифференцировочного потенциала
функциональной активности выделенных культур.
1.3. Исследование миогенеза в культуре мультипотентных
мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, тимуса, печени и селезенки.
1.3.1 Спонтанная миогенная дифференцировка.
1.3.2. Направленная миогенная дифференцировка
1.4. Клеточная трансплантация i viv
1.4.1 Выбор экспериментальной модели.
1.4.2. Дизайн эксперимента.
1.4.3. Трансплантация клеток.
1.4.4. Оценка результатов
Заключение
Выводы.
Список литературы


Впервые выделены и охарактеризованы мул ьти потентные мезенхимальные стромальные клетки тимуса человека. Впервые показана способность к спонтанной дифференцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, тимуса и печени в скелетную и сердечную мышцу. Мул ьти потентные мезенхимальные стромальные клетки селезенки, в отличие от ММСК костного мозга, тимуса и печени такой способности не проявляли. Практическая значимость работы. Впервые разработан протокол получения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток тимуса. Показана перспективность применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток тимуса в качестве клеточного аллотрансплантата, благодаря его значительно меньшей, по сравнению с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками из других источников, иммуногенности и высокой технологичности получения культуры. Определены условия отбора клеточных популяций, предпочтительно дифференцирующихся в миобласты. Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Втором Международном Конгрессе Биотехнология состояние и перспективы развития Москва, , Конференции в РГМУ Москва, , , VIII Ежегодной сессии МЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН Москва, , I, II международной конференции Молекулярная медицина и биобезопасность, Москва, , , на межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН Москва, март . Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 9 работ, из них 6 статей в центральной печати. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 7 страницах и состоит из введения, обзора литературы глава 1, описания материалов и методов исследования глава 2, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения глава 3, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 3 таблицами и рисунками. Указатель цитируемой литературы включает 7 источников. Глава I. В течение длительного времени дискутировался вопрос, приходят ли клетки, вовлеченные в процессы репарации, извне, или же они имеют локальное происхождение. Было показано, что при пересадке костного мозга радиационно облученным животным может заново формироваться костная ткань. Тот факт, что в костном мозге могут присутствовать клетки, которые можно выделить и которые способны превращаться в остеобласты и формировать эктопическую костную ткань, был впервые показан А. Я. Фриденштейном и соавторами на морской свинке. В году Фриденштейн изолировал фибробластоподобные клетки из костного мозга, используя их способность прикрепляться к пластику . Фибробластоподобные клетки составляют 0,10, от общего количества ядросодержащих клеток костного мозга, что примерно в раз меньше, чем количество гемопоэтических стволовых клеток ГСК, но фибробластоподобная популяция может легко выращиваться в культуре. Фриденштейн А. Я. описал колониеобразущие единицы фибробластов КОЕФ, которые формируются мелкими веретеновидными фибробластоподобными клетками, после того как они прикрепились к пластику. КОЕФ абсолютно необходима фетальная сыворотка телят. Большинство КОЕФ не пролиферируют i viv, однако через часов культивирования i vi КОЕФ входят в фазу и проходят часовой митотический цикл . Эти колонии поддерживали высокую вариабельность в размерах 1 до клеток и фенотип, маленькие веретенообразными пролиферирующими клетками или большими покоящимися распластанными 5. Используя данные, полученные из этих ранних исследований, ряд ученых попытались пролить свет на физиологию и функцию КОЕФ ,. В е г. ММСК может некоторым образом имитировать парадигму гемопоэтической системы стволовые клетки способны поддерживать недифференцированный статус и давать рост коммитироваиным клеткам в одно и то же время . Эта модель поддерживалась тем фактом, что прикрепленные фибробластоподобные клетки могут пассироваться в культуре генераций без признаков дифференцировки. Затем при подходящих условиях мезенхимальные прогениторные клетки могут дифференцироваться в один из многих фенотипов, включая хондроциты, остеобласты, адипоциты и миобласты 5.