Влияние трансплантации мезенхимных стволовых клеток на течение экспериментального инфаркта миокарда

• Автор: Кругляков, Петр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 160 с.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Стволовые клетки

. 1. 1. Эмбриональные стволовые клетки.

1.1.2. Стволовые клетки дифференцированных тканей взрослого организма.

1.1.3. Мезенхимные стволовые клетки.

1.2. Терапия инфаркта миокарда,

1.2.1. Инфаркт миокарда.

1.2.2. Терапевтические подходы к лечению инфаркта миокарда.3
1.2.3. Стимуляция эндогенной регенерации миокарда.
1.2.4. Трансплантация фетальных и неонатальных кардиомиоцитов.
1.2.5. Реимплантация миобластов в область повреждения.
1.2.6. Мобил изация эндогенных стволовых клеток.
1.2.7. Клеточная терапия повреждений миокарда с применением мононуклеарной фракции
костного мозга
1.2.8. Клеточная терапия повреждения миокарда с применением ГСК.
1.2.9. Клеточная терапия повреждений миокарда с применением МСК.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.
2.1. Выделение и культивирование МСК крысы.
2.2. Фенотипирование МСК крысы.
2.3. Дифференцировка МСК крысы в ортодоксальных направлениях.
2.3.1. Дифференцировка МСК крысы в остеоцитарном направлении
2.3.2. Дифференцировка МСК крысы в хондроцитарном направлении.
2.3.3. Диф1еренцировка МСК крысы в адипоцитарном направлении
2.4. Дифференцировка МСК крысы в кардиомиоцитарном направлении.
2.5. Фенотипирование дифференцированных производных МСК
2.6. Окрашивание мезенхимных стволовых клеток крысы флуорохромом РКН .
2.7. Моделирование экспериментального инфаркта миокарда ЭИМ
2.8. Введение МСК животным.
2.9. Фиксация материала, морфологический и гистологический анализ препаратов.
2 Иммуиогистохимическое окрашивание препаратов миокарда
. Иммуиогистохимическое окрашивание препаратов миокарда антителами против
коннексина .
. Иммуиогистохимическое окрспиивание препаратов миокарда антителами против
транскрипционного фактора ОАТА4 и тропонииа 1.
2 Анализ распределения МСК в организме подопытных и иптактных животных
2 Анализ распределения лизата МСК, окрашенных РКН, в миокарде подопытных животных
2 Количественная оценка васкуляризации зоны повреждения и измерение дилатации полостей сердца
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Мезенхимные стволовые клетки.
3.1.1. Характеристика культур МСК крыс
3.1.2. Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток в трх ортодоксальных направлениях и фенотипирование полученных производных.
3.1.3. Дифференцировка МСК в кардиомиоцитарном направлении
3.2. Динамика экспериментального инфаркта миокарда у крыс линии i .
3.2.1. Четвертые сутки после ЭИМ
3.2.2. Седьмы е сутки после операции ЭИ М.
3.2.3. Двадцать первые сутки после ЗИМ
3.2.4. Тридцать пятые сутки после ЭИ М
3.2.5. Сорок вторые сутки после операции ЭИ М.
3.3. Распределение МСК по организму интактных и подопытных животных.
3.3.1. Распределение МСК в организме интактного животного ЭИМ.
3.3.2. Распределение МСК в организме животного перенесшего ЭИМ
3.3.3. Трансплантация лизата мезенхимных стволовых клеток животным с ЭИМ
3.4. Динамика течения экспериментального инфаркта миокарда после трансплантации МСК.
3.4.1. Детекция донорских клеток в миокарде интактных и подопытных животных.
3.4.2. Морфологические особенности в строении ткани в зоне инфаркта миокарда у подопытных
животных
3.4.3. Выявление кардиомиоцитов периинфарктной зоны окрашенных II.
3.5. Сравнение степени дилатации полостей сердца у контрольных и подопытных животных после ЭИМ.
3.6. Анализ васкуляризации зоны ишемического повреждения у контрольных и подопытных животных
3.7. Регистрация изменений электрокардиограмм у контрольных и подопытных с введенными МСК животных после ЭИМ.
3.8. Влияние сроков внутривенного введения мезенхимных стволовых клеток при осложненном инфаркте.
3.8.1. Детекция флуоресцентно окрашенных мезенхимных стволовых клеток.
3.8.2. Особенности в строении рубцовой ткани при терапевтической трансплантации МСК.
3.8.3. Особенности в строении рубцовой ткани при профилактической трансплантации МСК
3.9. Изменение морфометрических параметров миокарда у крыс с ЭИМ при разных сроках трансплантации МСК.
ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Плюрипотентность ЭСК была показана в экспериментах по трансплантации этих клеток в бластоцисту зародыша и создании химерных организмов i. В эмбриональном развитии истинно плюрипотентные клетки существуют ограниченный промежуток времени. В современных лабораторных условиях возможно выделение ЭСК из бластоцисты и их культивирование. Получено множество линий ЭСК как экспериментальных животных грызунов, кроликов, собак, свиней, приматов, так и человека i ,. Это направление исследований привело к созданию одного из самых мощных современных методов исследования экспрессии генов технологии рекомбинантных эмбриональных стволовых клеток , i, . Эксплантация и поддержание ЭСК i vi выявила ряд важных моментов при работе с этими клетками. Культивирование ЭСК невозможно без дополнительных ростовых факторов и поддерживающего фидерного клеточного слоя. При их отсутствии происходит спонтанная дифференцировка клеток в различных направлениях i . Дифференцировка ЭСК i vi происходит с формированием трхмерных сферических структур в условиях культивирования в суспензии, получившие название эмбриоидные тела. Таким образом, ЭСК могут быть перспективным источником для заместительной терапии при самых различных заболеваниях Рега . Использование недифференцированных эмбриональных стволовых клеток в качестве инструмента клеточной терапии не дало ожидаемого результата. Спонтанная дифференцировка, характерная для этих клеток i vi, i viv наблюдалась лишь частично . В некоторых экспериментах трансплантация ЭСК приводила к формированию тератом из этих клеток ii . Однако показано, что тератогенное свойство ЭСК исчезает при их дифференцировке . ЭСК, комитированных к дифференцировке в одном направлении. Так, при трансфекции ЭСК мыши геном НохВ4 удалось получить гемопоэтические стволовые клетки. Трансплантация таких клеток первичным и вторичным реципиентам приводила к восстановлению кроветворения . Воздействие на ЭСК химического вещества 9 4,6двузамещенного пирролопиримидина комитировало клетки к нейрональной дифференцировке i . Трансфекция ЭСК геном и дополнительная обработка таких клеток фактором роста фибробластов8 8 приводили к формированию нейронов, схожих с нейронами среднего мозга развивающегося эмбриона i . Результаты данных экспериментов указывают на теоретическую возможность клеточной терапии с применением ЭСК, например, при лейкемии и болезни Паркинсона. Схожие эксперименты проводятся и в других областях экспериментальной клеточной терапии. Из ЭСК удалось дифференцировать 3клетки поджелудочной железы, гепатоциты, эндотелиальные клетки, остеобласты, хондробласты и кардиомиоциты . ЭСК интегрируются в миокард реципиента X . Итак, применение ЭСК в качестве агентов клеточной терапии имеет свои отрицательные стороны. Дифференцировка i vi не сопровождается 0 комитированием всего клеточного материала. Сохраняющиеся недифференцированные ЭСК способны к злокачественной трансформации. При помещении их в эктопические места взрослого животного ЭСК могут формировать тератомы. Методы культивирования ЭСК i vi не позволяют отказаться от ксеногенного или аллогенного фидерного слоя. ЭСК способны к спонтанному слиянию с соматическими клетками и, как следствие, к формированию химерных клеток со свойствами стволовых . Не исследован иммунный ответ организма на трансплантацию предифференцированных ЭСК. Не решены и этические вопросы применения ЭСК во многих странах существуют законодательные ограничения на работу с этими клетками. В течение жизни во взрослом организме постоянно происходит гибель клеток различных тканей, как при естественном обновлении апоптоз, так и при повреждениях некроз. Восстановление утраченных клеток происходит за счет камбиальных элементов i, i . В кишечнике, коже, мышцах, красном костном мозге, печени, головном мозге существуют пролиферирующие тканеспецифические популяции клеток i . В последние годы в тканях сформировавшегося организма были выявлены клеточные элементы, способные к дифференцировке не только в тканеспецифических направлениях, но и в клетки иного тканевого происхождения.