Роль адаптерных белков семейства Homer в регуляции рецептор-управляемых кальциевых каналов в клетках НЕК293

• Автор: Николаев, Антон Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 107 с.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Общие данные о депоуправляемых каналах

1. Первая регистрация каналов.

2. Агонисты каналов

3. Проводящие свойства каналов.

4. Механизмы регуляции каналов.

5. Инактивационные механизмы каналов.

6. Физиологическая значимость каналов

7. Ii каналы в клетках А1 и мышиных макрофагах.
Глава II. каналы и структура рецепторуправляемых каналов
1 .Номенклатура каналов
2. Доменная организация
3. Способы активации.
4. Роль в формировании субьеди ни иного состава
молекулы канала
5. Олигомерная организация каналов.
Глава Ш. Механизмы локализации элементов кальциевого сигнала в нейрональных и невозбудимых клетках. белки
1. Механизмы локализации молекул каскада фототрансдукции в фоторецепторах .
2. Локализация каналов в клетках млекопитающих.
3. белки как основные скэффолд белки в постсинапсе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Клетки.
Электрофизиология
4 Измерение внутриклеточной концентрации кальция
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
И и 1с
РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. и пассивное опустошение депо активируют вход кальция
через плазматическую мембрану
2.Изучение интегральных токов через рецепториндуцируемые
и депоуправляемые ионные каналы.
3.Изучение депоуправляемых и рецепториндуцируемых
кальциевых каналов на одиночном уровне. .
3.1. активирует низкопроводящие кальцийселективные депонезависимые каналы Ii.
3.2. Ii каналы в клетках НЕК3 регулируются уровнем Р1Рг плазматической мембраны
3.3. Активность Ii каналов в клетках НЕК3 в среднем ниже,
чем в клетках А1
3.4. активирует два типа депозависимых каналов в
плазматической мембране клеток НЕК3.
4. Белки семейства блокируют спонтанную активность
Ii каналов.
5. Для регуляции активности Ii каналов требуются
олигомерные комплексы белков.
ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


В связи с этим разделять различные рецепторуправляемые каналы можно только по их электрофизиологическим свойствам. Поэтому для изучения механизмов регуляции рецепторуправляемых кальциевых каналов требуется их регистрация на одиночном уровне. Ранее было показано, что в клетках А1 стимуляция рецепторов, сопряженных с фосфолипазой С, или приложение I3 к внутренней стороне плазматической мембраны активирует низкопроводящие кальциевые каналы в плазматической мембране. Эти каналы были названы Ii каналами и охарактеризованы в нескольких типах электроневозбудимых клеток iv . Данные каналы также активировались при пассивном опустошении кальциевых депо. Нами были получены данные, свидетельствующие о том, что в их активационном механизме важную роль играет рецептор I3 эндоплазматического ретикулума v . Мы также показали, что мембранный липид фосфатидилинозитол4,5бисфосфат Р1Р2 ингибирует активность Ii каналов v . Эти данные ставят вопрос о механизмах локализации элементов системы рецепторуправляемого входа кальция в электроневозбудимых клетках. Логично предположить, что должны существовать белки, связывающие в единый молекулярный комплекс фосфолипазу С, рецептор 1Рз и Ii канал в плазматической мембране. В постсинаптической плотности нейрональных клеток существует целый ряд скэффолд белков, сязывающих в единый макромолекулярный комплекс рецепторы, сопряженные с фосфолипазой С на постсинаптической мембране, рецептор 1Рз в мембране эндоплазматического ретикулума и другие функциональнозначимые белки постсинапса i, Ii, . Среди этих белков важную роль играют белки семейства . Р3 и глутаматный рецептор друг с другом и с другими белками . Как правило, мишени белков имеют последовательность XX или X. Белки семейства экспрессируются и в электроневозбудимых клетках, в частности в клетках НЕК3. Однако их функция в этих клетках неясна. Можно предположить, что эти белки могут связываться рецептором 1Р3 в мембране эндоплазматического ретикулума и кальциевым каналом в плазматической мембране и собирать их в единый макромолекулярный комплекс. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование роли белков семейства в регуляции активности каналов Ii. Охарактеризовать каналы рецепторуправляемого входа кальция в клетках НЕК3 на одиночном уровне. Выяснить как меняется активность каналов Ii в клетках НЕК3 при нарушении связи белков семейства с белками мишенями. Выяснить как меняется активность каналов Ii при нарушении олигомерной структуры белков семейства . Основные положения, выносимые на защиту. Рецепторуправляемый вход кальция в клетках НЕК3 опосредован как минимум тремя типами кальциевых каналов, одним из которых является Ii канал. Белки семейства блокируют спонтанную активацию Ii каналов. Для блокирования спонтанной активации Ii каналов требуются олигомерные комплексы белков семейства . Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые показано, что индуцированный вход кальция в клетках НЕК3 опосредуется тремя типами кальциевых каналов. Один из них это ранее изученный в клетках А1 миниатюрный кальциевый канал Ii. См и потенциал реверсии мВ. Ii каналов в клетках А1, не чувствителен к состоянию кальциевых депо. Два других рецепторуправляемых канала активируются пассивным опустошением кальциевых депо и имеют проводимости 5 и пСм. Кроме того, с помощью молекулярнобиологических и электрофизиологических методик было показано, что адаптерные белки ссхчейства блокируют спонтанную активацию каналов Ii. В работе также было показано, что для такого действия белков требуется их олигомерная организация. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания механизмов регуляции рецепторуправляемого входа кальция в электроневозбудимых и нейрональных клетках. Результаты, свидетельствующие о роли белков семейства в регуляции Ii каналов, безусловно расширяют представления о механизмах активации ионных каналов.