Изучение макромолекулярных комплексов хроматина животных и растений

• Автор: Шеваль, Евгений Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Высшие уровни организации хроматина

. 1 Хромонемы элементарные субструктуры

митотических хромосом

1.2 Судьба хромонемных элементов в интерфазе

1.3 Структурная организация хромонемы

1.4 Хромомериохромтемная модель

2. Радиальнопетельная модель

2.1 Скелетные структуры митотических хромосом

2.2 Петлевые домены интерфазных хромосом

2.3 Скелетные структуры интерфазного ядра
3. Заключение
МАТЕРИАЛ ИМШОЖКИ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Манипуляции с изолированными ядрами гепагоцитов крысы
1.1. Выделение ядер клеток печени крысы со стабилизированным а и нестабилизированым б ядерным матриксом.
1.2. Стабилизация ядерных компонентов облучением.
1.3. Получение и фиксация нуклеоидов.
2. Изучение интерхромагинового материала в клетках НеЬа
2.1. Пермеабилизация клеток и получение нуклеоидов.
2.2. Морфология нермеабилизированных
клеток и нуклеоидов.
2.3. Иммуноцптохимическое окрашивание.
3.Манипуляции с интерфазными ядрами клеток кулькуры СПЭВ
3.1. Клеточная культура.
3.2. Идентификация мастеров рент конов
в ядрах пермеабилизированных меток и в нуклеоидах.
3.3. Изучение аргентофильных белков в ядрах и нуклеоидах.
4. Манипуляции с митотическими хромосомами
клеток культуры СПЭВ
4.1. Клеточная культура.
4.2. Пермеабилизация и экстракция.
4.3. Микроскопия.
4.4. Ферментативные обработки.
5. Манипуляции с интерфазными ядрами корешков i сера
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Организация ядер и нуклеоидов со стабилизированным и
нестабилизиро ванным ядсрным матриксом
Результаты
. Структура изолированных ядер и нуклеоидов
на светомикроскопическом уровне.
2. Ультраструктура ядер и нуклеоидов
Обсуждение
1. Структура конденсированного хроматина и интерхюматипового материала в связи с состоянием ядерного матрикса
2. Принципы структурной организации нуклеоидов со стабилизированным и нестабилизированным
ядерным матриксом
Поведение ннтерхроматннового материала в холе псрмсабилизации и экстракции ядер в связи с состоянием ядерного матрикса
Результаты
1. Структура пермеабилизированных и экстрагированных клеток Нем на полутонках срезах
2. Распределение в метках, фиксированных i i, в
пермеабилизированных метках и в ядериом матриксе
Обсуждение
Изучение макромолекулярных комплексов интерфазных хромосом с использованием метода фотостабилизаыии хроматина
Результаты
. Динамика изменения ширины гало в нуклеоидах, полученных из ядер со стабилизированным и нестабилизированным ЯМ, в зависимости от дозы облучения
2. Ультрастура нуклеоидов со стабилизированным и нестабилизированным ядерным матриксом, в зависимости от дозы облучения
3. Поведение реплицирующегося хроматина в условиях фотостабилизации 5
4. Поведение аргентофильных белков ядрышка
в условиях фотостабилизации
Обсуждение
Изучение макромолекулярных комплексов митотических хромосом с использованием метода фотостабилизаини хроматина
. Характер окшиивання хромосом меток С НЭП бромистым этидием
2. Световая микроскопия
3. Действие нукяеаз и нротесп
на фотостаби,визированные хромосомы
3. Электронная микроскопия митотических клеток
Обсуждение
1. Биохимические особенности фотистабилизированных
хромосом
2. Структура фютостабилтированного хроматина в митозе
Изучение макромолекулярных комплексов интерфазных ядер i сера
Результаты
Обсуждение
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Более того, есть определенные сомнения в том, что ядерный матрикс и скэффолд существуют i viv, а не являются артефактами, возникающими в ходе манипулирования с ядрами и хромосомами i vi , , , , , . Для высших уровней компактизации ДНК ситуация еще более неясная Иногда высшие уровни организации трактуются как результат неспецифической агрегации ДНПфибрилл в физиологических условиях vi, . Высказывалось также предположение, что в поддержание структурной целостности хромонем могут быть вовлечены компоненты ядерного матрикса , , . Также заслуживает внимания гипотеза, по которой в организацию высших уровней компактизации хроматина вовлечены специальные структурные негисгоновые белки скрепочные белки v . Данные литературы позволяют предполаг ать, что в интерфазмых ядрах имеется система пеидентифицированиых структурных белков, которые не являются компонентами собственно ядерного матрикса и которые играют важную роль в компактизации макромолекулярных комплексов хроматина. Таким образом, теоретически в интерфазном ядре могут сосуществовать различные системы, обеспечивающие структуризацию хромосом Одна, включающая в себя белки ядерного матрикса, обеспечивает в ядре иммобилизацию структурнофункциональных локусов хромосом оснований петлевых доменов и активных генов, тогда как другая, в состав которой входят гипотетические структурные белки, участвует только в компактизации ДНК. Таким образом, в проблеме структурной организации хроматина и хромосом тесно переплетаются цитологические и биохимические задачи, что делает невозможным ее решение методами одного какоголибо подхода. Проблема требует разработки новых методов, которые могли бы позволить стабилизировать структурный и химический состав хроматина в процессе его изоляции, избежав при этом использования химических агентов, вызывающих модификацию белков иили ДНК. Одним из таких методов является фотостабилизация хроматина Ямшанов и др. Показано, что облучение видимым светом в присутствии фотосенсибилизирующего агента бромистого этидия не стабилизирует гистоны, но сохраняет в составе хроматина негистоновые белки Ямшанов и др. В работе использованы микроскопические методики, что представляется оправданным, т. Определить роль компонентов ядерного матрикса в организации конденсированного хроматина животных и растительных ядер. Изучить роль компонентов ядерного матрикса в организации различных функциональных субдоменов интерфазных ядер. Изучить роль нематриксмых негистоновых белков в организации макромолекулярных комплексов интерфазных и митотических хромосом. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
За многолетнюю историю изучения строения хромосом было предложено большое число различных моделей, часто кардинально отличающихся по принципам, положенным в их основу. Тем не менее, вс разнообразие этих моделей можно свести в две группы. К первой группе относятся модели, в которых заложен принцип иерархичности, т. ДНК. В качестве примера можно упомянуть скрепочную модель, предложенную Зацепиной с соавт. В этой модели постулируется существование уровней компактизации, промежуточных между элементарной хромосомной фибриллой и целой хромосомой. Однако в большинстве моделей в качестве конечного уровня организации расматривается соленоидная элементарная фибрилла Процесс ее дальнейшей укладки может быть либо случайным и неупорядоченным, как это предполагал ДюПро , , либо подчиняться принципу петельной укладки, как это постулируется в радиальнопетельной модели i . Радиальнопетельная модель получила в настоящее время наибольшее распространение, хотя в ней и не признается существование высших уровней организации хроматина. Хромонемы элементарные субструктуры митотических хромосом При электронномикроскопическом изучении метафазных хромосом, фиксированных i i, тело хромосомы образовано плотно упакованными нм фибриллами Ченцов, Поляков, . Единственной субструктурой изолированных митотических хромосом, осажденных на электронномикроскопические сеточки также являются нм фибриллы. В рамках радиальнопетельной модели в качестве конечного уровня упаковки хроматина рассматривается только им фибрилла.