Изучение роли митотической киназы Aurora A в развитии наследственной поликистозной болезни почек человека

• Автор: Плотникова, Ольга Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1 Общие представления о поликистозной болезни почек

1.2 Клинические и гистологические особенности Г1БП

1.3 Механизмы развития 1ГБП

1.4 Структура и функция полицистина1 и пол иди стина2 белков, мутированных при ПБП

1.5 Кальций и клеточная пролиферация. Роль полицистинов в поддержание гомеостаза кальция в почечном эпителии

1.6 Локализация полицистина2 в почечной клетке определяет его функции

1.7 Первичная ресничка и се роль в патогенезе ПБП
1.8 Направления влечении ПБП
1.9 Киназы семейства
1. Структура и регуляция киназы
1. Роль киназы в регуляции пролиферации клеток
1. Роль киназы в индукции разборки первичной реснички
1. Активатор киназы 9 1
Глава II. Материалы и методы исследования
2.1 Объекты исследования
2.2 Реактивы
2.3 Методы исследования
2.3.1 Клонирование
2.3.2 Клеточные культуры и трансфекция
2.3.3 Получение лизатов, коиммунопреципитация и иммуноблотинг
2.3.4 Получение рекомбинантных белков
2.3.5 Анализ киназной активности i vi
2.3.6 Иммунохимическое исследование
2.3.7 Иммунофлуоресцентиый анализ
2.3.8 Измерение концентрации внутриклеточного кальция.
2.3.9 Индукция формирования первичной реснички
2.3. Измерение цитотоксичности РНА
2.3. Исследование последовательности фаз клеточного цикла методом проточной иитофлуоромстрии
2.3. Статистическая обработка результатов
Глава III. Результаты и обсуждение
3.1 Локализация и активность АигА в почечном эпителии
3.2 Экспрессия киназы АигА в кистозном эпителии и определение уровня фосфорилированной АигА у больных ПБГ
3.3 Выбор модели для изучения регуляции почечных белков полицистина1 и 2
3.4 Изучение роли киназы АигА в регуляции полицистина1 в первичной реснички почечных клеток линии НК2
3.5 Выбор модели для изучения регуляции киназой АигА функции кальциевого канала, образованного РС2
3.6 Активация АигА в ответ на стимулы, ведущие к увеличению концентрации внутриклеточного 2
3.7 Киназа АигА негативно реулируст функцию кальциевого канала РС2, снижая содержания Са в цитоплазме почечных клеток
3.8 Связывание и фосфорилирование киназой АигА Стерминального домена полицистина2
3.9 Функциональный анализ мутаций в сайте фосфорилирования АигА
3. Изучение приложения ингибитора киназы АигА в терапии ПБП
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы


Есть все основания полагать, что первичные реснички, присутствующие на поверхности почечных эпителиальных клеток, являются механосенсорными органеллами, которые инициируют широкий спектр передачи Са7опосредованпых регуляторных сигналов, причем в данном случае реснички отслеживают скорость тока мочи через канальцы и собирательные трубочки 8,9. В результате воздействия на первичную ресничку механических стимулов происходит инициация входа Са2 в цитоплазму, что запускает каскад сигналов, регулирующих пролиферацию клеток 4. При вступлении клетки в митоз происходит потеря первичной реснички вследствии того, что базальное тело, находящееся в ее основании, участвует в формировании центросомы диплосомы 6. Было показано, что одним из признаков опухолевых трансформированных клеток как раз является потеря первичной реснички 2. Эти и другие данные, демонстрирующие, что в первичной ресничке локализовано большое количество различных групп митотических белков, например, таких как семейство МЕКкиназ, участвующих в регуляции митоза 4, позволяет предположить, что целостная первичная ресничка шрает важную роль в рефляции клеточного цикла. Более того, полученные в последние годы данные указывают, что развитие ПБП часто сопровождается уменьшением или полной утратой первичной реснички почечным эпителием 0. Са , способствует расстройству регуляции клеточного цикла, что ведет к неконтролируемой пролиферации клеток и формированию кист. В настоящее время картина молекулярных механизмов, контролирующих функции дифференцированных клеток в почке постепенно проясняется. Интересно, что хорошо изученная как митотическая киназа, располагающаяся на полюсах веретена деления начиная с профазы и до окончания телофазы и участвующая в регуляции клеточного цикла , может являться одним из ведущих белков, контролирующих пролиферацию почечного эпителия. Ген Лиг А, картируется в областях хромосом, часто нарушаемых при опухолях . Избыточная экспрессия или несвоевременная активация киназы вызывает нарушение регуляции прохождения клетки по клеточному циклу, что сопровождается увеличением количества центросом и анеуплоидией, в отдельных случаях ведущих к трансформации клеток млекопитающих ,3. Следует отметить, что одним из начальных этапов развития кист является как раз нарушение в регуляции нормальной пролиферации клеток с появлением мультицентросомных клеток с последующим изменением их структуры , что, скорее всего, может свидетельствовать о существенной роли киназы в этих процессах. Недавно было обнаружено, что киназа локализована в базальном теле первичной реснички и была показана ее ключевая роль в инициации разборки и последующей потери клеткой этой структуры 6. Выше описанная роль киназы в инициации разборки первичной реснички и регуляции клеточного цикла позволяет нам рассматривать киназу как новый маркер ПБП, которая безусловно вовлечена в патогенез ПБП. Изучение роли митотической киназы А в нарушении пролиферации клеток почечного эпителия при развитии наследственной поликистозной болезни почек человека. Продемонстрировать локализацию киназы в нормальной почечной ткани и изучить возможность гиперактивации киназы у больных поликистозной болезнью почек с использованием иммуногистохимических методов. Выбрать модель, позволяющую изучать роль киназы в регуляции полицистинов, белков, мутированных при ПБП, с применением биохимических методов, и приемлемую для дальнейших функциональных исследований. Ответить на вопросы взаимодействует ли киназа с полицистином1 и полицистином2 и регулирует ли их активность путем фосфорилирования Оценить функциональную значимость взаимодействия с полицистинами и показать роль ингибитора в регуляции этих белков. Работа содержит новые данные о роли киназы в развитии поликистозной болезни почек ПБП. известна как киназа, участвующая в регуляции митоза и прохождения клеткой через 2 фазы клеточного цикла . Ранее не было известно о локализации киназы в клетках почечного эпителия и, тем более, не была изучена роль этой киназы в ПБП. В данной работе впервые показано, что уровень активированной путем фофсорилирования киназы повышен в эпителии, выстилающем просвет кист у больных ПБП в отличие от интактного эпителия.