Хромосомный набор и размер генома у микроспоридии Paranosema grylli

• Автор: Насонова, Елена Станиславовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 225 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Строение ядра и хромосомного аппарата микроспоридий

1.1.1. Общая организация ядра.

1.1.2. Митоз у микроспоридий

1.1.3. Половой процесс у микроспоридий закономерности изменения плоидности ядер диплокариона

1.1.4. Хромосомные циклы микроспоридий. Классификация жизненных циклов.

1.2. Способы изучения кариотипа у протистов.

1.3. Кариотипирование протистов с помощью метода пульсэлектрофореза
1.4. Определение размера генома и уровня плоидности у протистов.
1.5. Молекулярные кариотипы, размер генома и хромосомный
полиморфизм у микроспоридий.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1. Методы лабораторной работы с микроспоридией Рагаповета дгуШ
2.1.1. Происхождение культуры микроспоридии.
2.1.2. Поддержание микроспоридии в культуре насекомыххозяев
2.1.3. Выделение и очистка стадий жизненного цикла микроспоридии
из жирового тела сверчка
2.1.4. Стимуляция экструзии полярных трубок из спор Р. дгуШ и получение
препарата спороплазм
2.2. Методы световой и электронной микроскопии
2.2.1. Световая микроскопия и гистохимическое окрашивание.
2.2.2. Трансмиссионная электронная микроскопия
2.3. Методы цитометрии
2.3.1. Кислотный гидролиз и окрашивание препаратов для цитометрии.
2.3.2. Измерение содержания ДНК в ядрах диплокариона с помощью цитометрии по изображению.
2.4. Базовые молекулярнобиологические методы.
2.4.1. Выделение геномной ДНК из спор Р. дгуШ.
2.4.2. Амплификация ДНК.
2.4.3. Клонирование продуктов ПЦР.
2.4.4. Секвенирование ДНК.
2.4.5. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.
2.5. Молекулярное кариотипирование
2.5.1. Приготовление образцов высокомолекулярной хромосомной ДНК
Р. дгуШдпя пульсэлектрофореза
2.5.2. Приготовление агарозных блоков с размерными маркерами
для пульсэлектрофореза.
2.5.3. Пульсэлектрофорез хромосомной ДНК.
2.5.4. КАИ0 РРвЕ
2.5.5. Гибридизация по Саузерну.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Изучение структуры диплокариона и хромосомного аппарата
Рагаповета дгуШ.
3.1.1. Интерфаза
3.1.2. Митоз и цитокинез
3.1.3. Мейоз
3.2. Изучение молекулярного кариотипа микроспоридии Рагапоэета дгуШ
3.2.1. Фракционирование хромосомных ДНК Р. дгуШ с помощью пульсэлектрофореза.
3.2.2. Особенности молекулярного кариотипа микроспоридии Р. дгуШ.
3.3. Идентификация индивидуальных хромосом в молекулярном кариотипе Рагаповета дгуШ с помощью двумерного пульсэлектрофореза рестрикционных фрагментов хромосомных ДНК КАЯй РРСЕ
3.4. Локализация генспецифичных зондов на хромосомах Рагапоэета дгуШ
3.4.1. Гибридизация с ДНКзондами к однокопийным
белоккодирующим генам.
3.4.2. Локализация ДНКзонда к гену Э рРНК.
3.5. Определение абсолютного содержания ДНК в спорах
Рагаповета дгуШ и оценка уровня плоидности ядер диплокариона.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Особенности организации диплокариона и хромосомного аппарата у Рагапоаета дгуШ
4.1.1. Интерфаза.
4.1.2. Митоз.
4.2. Особенности протекания мейоза и его место в жизненном цикле Рагапоэвта дгуМ
4.2.1. Морфологические маркеры мейоза у Р. дгуШ сравнение с другими микроспоридиями.
4.2.2. Место мейоза в жизненном цикле Р. дгуШ.
4.3. Хросомный набор микроспоридии Рагапозета дгуШ. Полиморфизм гомологичных хромосом и его возможные причины.
4.3.1. Популяционная структура Р. дгуШ
4.3.2. Уровень плоидности диплокариона микроспоридий
4.3.3. Возможные сценарии хромосомных перестроек в ходе
пролиферации Р. дгуШ
4.3.4. Репродуктивная стратегия Р. дгуШ.
4.3.5. Функциональное значение хромосомного полиморфизма
4.4. Хромосомный репертуар и размер генома Рагапоэвта дгуШ
в сравнении с другими микроспоридиями.
4.5. Биологическое значение межъядерной гомогенизации геномов и возможные варианты ее реализации у мономорфных
диплокариотических микроспоридий
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Хазард с соавторами впервые документировали поэтапное изменение конфигурации хромосом, характерное для мейоза, у . Эти исследователи документировали четыре из пяти фаз профазы I в диплокариотических споронтах и впервые описали мейотический кариотип у микроспоридии. Гаплоидное число хромосом у этого вида оказалось равным семи. Было отмечено, что максимальной конденсации хромосомы достигают на стадии диакинеза и что хиазмы между гомологами не формируются. Параллельно авторы этой статьи продемонстрировали наличие синаптонемных комплексов в ядрах тех же стадий жизненного цикла на электронномикроскопическом уровне. Позднее Хазард и Брукбэнк впервые осуществили микрофотометрию ДНК в окрашенных по Фельгену ядрах микроспоридии. Эти исследователи впервые наблюдали кариогамию в диплокариотических меронтах и последующее редукционное деление в ранних споронтах на одном из этапов полиморфного гетероспорового жизненного цикла . Впоследствии, опираясь на эти наблюдения, были сделаны основополагающие выводы о плоидности ядер диплокариона и о чередовании гапло и диплофазы точнее, гапло, дигапло и диплофазы в жизненных циклах микроспоридий i . В соответствии со схемой редукционного деления у . Хазардом и Брукбэнком и обобщенной в обзоре Каннинг i , прохождению мейоза в диплокариотических меронтах предшествует кариогамия Рис. А Б. Ядерная оболочка в области контакта между ядрами исчезает, и ядра сливаются. Авторы статьи полагают, что изначально ядра, входящие в состав диплокариона, гаплоидны. Следовательно, после кариогамии они образуют единое диплоидное ядро. Рис. В. Однако ядра во вновь сформировавшемся диплокарионе примерно в два раза крупнее, чем были прежде. Было высказано предположение, что диплокариотическое состояние восстанавливается посредством репликации хромосом и митоза. Следовательно, каждое ядро вновь образованного диплокариона имеет диплоидный набор хромосом. Таким образом, на данном этапе диплокарион является тетраплоидным образованием. Рис. Схема редукционного деления, которое имеет место в ходе одного из этапов жизненного цикла микроспоридий рода , протекающего в личинках самцов комаров. ДНК с в каждом из ядер на разных стадиях например, 1п1с, 2п1с и т. Несколько позднее диплокариотическая организация ядерного аппарата опять нарушается Рис. Г. Ядра отходят друг от друга, но не расходятся к разным концам клетки, а остаются сближенными. Здесь важно отметить, что, по наблюдениям авторов, содержание ДНК в каждом из ядер остается неизменным по сравнению с предыдущим этапом. В каждом из ядер синхронно начинается процесс, который исследователи назвали мейозоподобным, поскольку на светомикроскопическом уровне наблюдали типичные для лептотены, зиготены и начала пахитены конфигурации хромосом. Другими словами, эти этапы профазы I проходят синхронно и независимо в каждом из ядер диплокариона. На стадии пахитены Рис. Д ядра опять сливаются, и происходит процесс смешивания ii хромосом. Интересно отметить, что на этом этапе авторы зафиксировали двукратное увеличение содержания ДНК в ядре по сравнению с предыдущим этапом вследствие слияния ядер и, соответственно, четырехкратное увеличение содержания ДНК по сравнению с исходным уровнем, отмеченным у диплокариотического меронта. Далее наблюдали все последующие стадии мейоза и еще одно митотическое деление с предшествующей репликацией ДНК, приводящие к формированию 8 одноядерных споробластов октоспоробластическая спорогония, дающих начало 8 монокариотическим гаплоидным спорам Рис. Е К. Существенным недостатком подачи данных и их анализа в статье Хазарда и Брукбэнка, за что их впоследствии критиковали i , является смешение в обозначениях и в обсуждении двух разных понятий уровень плоидности и содержание ДНК в ядре. Независимо от того, велась ли речь о синтезе ДНК и, следовательно, появлении хромосом, состоящих из двух хроматид или о слиянии или расхождении ядер и, соответственно, удвоении или уменьшении в два раза числа хромосомных наборов, исследователи использовали обозначение уровень плоидности см. Рис.