Механизмы регуляции катионных каналов в эукариотической клетке

• Автор: Морачевская, Елена Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 243 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРНО

ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН КОНЦЕПЦИЯ ЛИПИДНЫХ МИКРОДОМЕНОВ

1.1. Латеральная гетерогенность липидного бислоя

1.2. Мембранный холестерин и липидные микродомены рафты

1.3. Детергентустойчивые мембраны и концепция липидных рафтов

1.4. Возможности визуализации липидных рафтов

1.5. Роль липидных рафтов в процессах клеточной сигнализации

1.6. Взаимосвязь рафтов и актинового цитоскелета

1.7. Возможное участие холестерина и рафтов в регуляции ионных

каналов клеточных мембран Глава 2. МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ.

2.1. Функциональные свойства и принципы классификации
2.2. Воротные характеристики
2.3. Фармакологические свойства
2.4. Транспорт двухвалентных катионов
2.5. Потенциальные активаторы механочувствительных каналов
2.6. Роль цитоскелета в функционировании каналов
2.7. Молекулярная структура и модели активации
Глава 3. НАТРИЙСЕЛЕКТИВНЫЕ КАНАЛЫ
ПОТЕНЦИАЛУПРАВЛЯЕМЫЕ И ПОТЕНЦИАЛНЕЗАВИСИМЫЕ
3.1. Транспорт натрия и актиновый цитоскелет
3.1.1. Локализация транспортных белков
3.1.2. Модуляция активности ионных каналов
Глава 4. КАТИОННЫЕ КАНАЛЫ СЕМЕЙСТВА ОЕСЕИаС И
МЕХАНОТРАНСДУКЦИЯ
4.1. Оценка механочувствительности каналов ЕЫаС с помощью
различных экспериментальных моделей.
4.2. Активация ЕС при стимуляции потоком жидкости
4.3. Возможные механизмы механочувствительности ЕС
4.4. Механосенсорные функции в различных тканях возможное участие каналов ВЕОЕЫаС
Глава 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
5.1. Клетки
5.2. Регистрация ионных токов
5.3. Механическая стимуляция
5.4. Обработка данных
5.5. Растворы
5.6. Актин и актинсвязывающие белки
5.7. Флуоресцентная микроскопия
5.8. Модификация липидного состава
Глава 6. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
6.1. Потенциалуправляемые натриевые каналы и роль карбоксильных групп в их активации
6.2. Потенциалнезависимые натриевые каналы
6.3. Активация и инактивация потенциалнезависимых 1 натриевых каналов
6.3.1. Разборка микрофиламентов вызывает активацию каналов
6.3.2. Инактивация каналов при полимеризации актина
6.4. Регуляция активности натриевых каналов при участии 8 копирующего белка
6.5. Активация каналов в нативных клетках при повышении 4 уровня внутриклеточного кальция
6.6. ГТФзависимая регуляция натриевых каналов
6.6.1. Активация каналов при действии негидролизуемого аналога ГТФ
6.6.2. Влияние вактина на активность каналов, индуцированную ЭТРуЭ
6.6.3. Механизм ГТФзависимой модуляции активности каналов
6.7. Функциональные свойства натриевых каналов в клетках 2 с пониженным содержанием холестерина
6.7.1. Характеристики каналов в клетках К2 после 5 частичной экстракции холестерина
6.7.2. Активация и инактивация каналов в модифицированных клетках
6.8. Идентификация механочувствительных катионных каналов 3 плазматической мембраны
6.8.1. Механозависимая активация ионных токов
6.8.2. Проводимость и селективность механочувствительных каналов
6.8.3. Действие ингибиторов
6.9. Кальциевая проницаемость и блокирование 2 механочувствитольных каналов
6 Проницаемость механочувствительных каналов 4 для ионов магния
6 Влияние осмотичности среды на активность ионных каналов
6 Влияние модификаторов цитоскелета на характеристики 2 механочувствительных каналов в клетках К
. Анализ эффектов деструкторов актина
. Исследование действия колхицина и нокодазола
6 Участие мембранного холестерина в регуляции 2 механочувствительных каналов и актинового цитоскелета
Глава 7. ОБСУЖДЕНИЕ
7.1. Роль актинового цитоскелета в регуляции 5 потенциалнезависимых натриевых каналов.
7.1.1. Копирование микрофиламентов модулирует активность каналов
7.1.2. Реорганизация цитоскелета опосредует ГТФзависимую 3 регуляцию каналов
7.1.3. Функциональная связь каналов с динамикой актина 7 в условиях деструкции рафтов
7.2. Механозависимая регуляция катионных каналов
в клетках эукариот
7.2.1. Механочувствительные каналы и двухвалентные катионы
7.2.2. Роль цитоскелета и липидного бислоя в функционировании 9 механочувствительных каналов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список литературы


Это принципиальное отличие от свободных фосфоинозитидов, локализованных, как правило, во внутреннем монослое плазматической мембраны. Присутствие некоторых трансмембранных белков в составе микродоменов может определяться размером гидрофобного домена, а также аминокислотными последовательностями внеклеточных и цитоплазматических фрагментов, имеющих специфическое сродство к типичным рафтсвязанным белкам i . Недавние исследования подтверждают предположения о том, что связывание определенных белков с липидами и стабилизация бислоя за счет белоклипидных взаимодействий способствует формированию рафтов. Так, при анализе распределения ацилированных белков в плазматической мембране показано, что повышение уровня их экспрессии не приводит к повышенной ассоциации с рафтами . Доля и белков, организованных в нанокластеры , составляет около вне зависимости от уровня экспрессии. Эти результаты не соответствуют точке зрения, что белки встраиваются в рафты, ранее существующие в мембране. Авторы предлагают динамическую модель образования микродоменов, размер которых может не превышать 6 А. Следует отметить, что полученные результаты касаются сигнальных белков, кластеризующихся в пределах внутреннего монослоя. Кроме того, показано, что при разборке актинового цитоскелета рафты не формируются, а передача сигнала блокируется на уровне киназы . В совокупности, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что образование рафтов это единый процесс, включающий структурирование липидов и мембранных белков. Вряд ли основным механизмом является присоединение белков к предсуществующим упорядоченным микродоменам. Более вероятно, что типичные рафтассоциированные трансмембранные белки выступают как центры кристаллизации в процессах формирования и динамики рафтов в клеточных мембранах. Еще один важнейший фактор, возможно, определяющий структурнофункциональную организацию липидных рафтов это связь с примембранными микрофиламентами. В связи с ограничениями оптической микроскопии визуализация рафтов в нативных клетках остается трудноразрешимой задачей. Первый, и долгое время единственный метод, основан на применении субъединицы iiv i токсина, выделенного из холерного вибриона xi. Холерный токсин СТ, xi представляет собой олигомерный комплекс, состоящий из 6 субъединиц одной Асубъединицы и пяти Бсубъединиц АВ5, рис. Бсубъединицы, каждая массой кДа, образуют пятичленное кольцо. Асубъединица состоит из А1 и А2субдоменов i, , . А1субдомен обладает ферментативной активностью способностью к рибозилированию альфасубъединицы гетеротримерного белка , Как известно, эта модификация вызывает конститутивную выработку цАМФ, что в итоге приводит к секреции воды и ионов в просвет тонкого кишечника и известной симптоматике быстрому обезвоживанию организма. Субдомен А2 обеспечивает соединение А1 и Бчастей. За связывание холерного токсина с клеточной мембраной отвечают Бсубъединицы . Известно, что Бсубъединица присоединяется к ганглиозиду 1 рис. Рис. Олигомерная структура АВ5 холерного токсина, включающего Асубъединицу розовый цвет, показаны субдомены А1 и А2 и пять Бсубъединиц голубой цвет. Первый, и долгое время единственный метод, основан на применении субъединицы iiv i токсина, выделенного из холерного вибриона xi. Холерный токсин СТ, xi представляет собой олигомерный комплекс, состоящий из 6 субъединиц одной Асубъединицы и пяти Бсубъединиц АВ5, рис. Бсубъединицы, каждая массой кДа, образуют пятичленное кольцо. Асубъединица состоит из А1 и А2субдоменов i, , . А1субдомен обладает ферментативной активностью способностью к рибозилированию альфасубъединицы гетеротримерного белка , Как известно, эта модификация вызывает конститутивную выработку цАМФ, что в итоге приводит к секреции воды и ионов в просвет тонкого кишечника и известной симптоматике быстрому обезвоживанию организма. Субдомен А2 обеспечивает соединение А1 и Бчастей. За связывание холерного токсина с клеточной мембраной отвечают Бсубъединицы . Известно, что Бсубъединица присоединяется к ганглиозиду 1 рис. Рис. Олигомерная структура АВ5 холерного токсина, включающего Асубъединицу розовый цвет, показаны субдомены А1 и А2 и пять Бсубъединиц голубой цвет.