Морфологический и молекулярный анализ ангиогенеза при моделировании ишемии и реваскуляризации миокарда

• Автор: Сергеевичев, Давид Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Костный мозг как источник клстокпредшественпиков неоваскулогенеза

1.2 Особенности эмбриогенеза сосудистой системы

1.2.1 Эндотелиальные клетки во время эмбрионального развития

1.2.2 Формирование первичного капиллярного сплетения

1.2.3 Рсмодслирование капиллярного сплетения в артерии и вены

1.2.4 Молекулярные маркеры эндотелиальных клеток

1.3 Формирование сосудов и ангиогенные факторы
1.3.1 Модель формирования сосудов
1.3.2 Вазоэндотелиальные факторы роста их разновидности и рецепторы
1.3.3.Регуляция V .
1.3.4 Ангиопоэтины и их iрецспторы
1.3.5 и стабилизация клеточной стенки
1.3.6 2 агонист или антагонист
1.4 Лектины
1.5 Резюме ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Общая структура эксперимента
2.2 Характеристика материала
2.3 Моделирование хронической ишемической болезни сердца
2.4 Получение мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга и разделение ее на фракции
2.5 Морфологическое исследование образцов.
2.6 Иммуногистохимические и иммуноцитохимические методы исследования
2.7 Молекулярные методы исследования
2.8 Проточная цитофлюориметрия
2.9 Исследование фракций МНК КМ после культивирования
в средах направленной клеточной дифференцировки
2. Оценка перфузии миокарда с использованием тТс
2. Статистические методы исследования ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца
3.2 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации прилипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга
3.3 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации неприлипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга
в лазерные каналы
3.4 Морфометрический анализ миокарда при проведении реваскуляризации
3.5 Проточный цитофлюориметрический анализ популяций клеток
3.6 Оценка уровня экспрессии геновмаркеров хондроостеогенеза
3.7 Оценка уровня экспрессии генов вазоэндотелиальпых факторов роста в сепарированных мононуклеарных клетках костного мозга
3.8 Исследование уровня экспрессии мРНК генов V
и в ишемизированном миокарде и зонах реваскуляризации
3.9 Иммуноцитологическое исследование клеточных популяций
в средах направленной дифференцировки
3. Анализ перфузии миокарда по данным сцинтиграфии после операции комплексной реваскуляризации
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ
Практические рекомендации СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
кДНК кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота
МК мононуклсарныс клетки
МНФ мононуклеарная фракция
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
МСК мезенхимальные стволовые клетки
ОТПЦР обратная транскрипция полимеразная цепная реакция
ПК периферическая кровь
СКК стволовые кроветворные клетки
ТМЛР трансмиокардиальная лазерная реваскуляризация
ХИБС хроническая ишемическая болезнь сердца
ЭК эндотелиальные клетки
ЭП эндотелиальные клеткииредшественники
Аг ангиогенин
ОАР1 диамидино2фенилиндол
Г1ТС флюоресцсин изотиоцианат
СБР зеленый флюоресцирующий белок
БЭР стромальноклсточный фактор
Т1е рецептор ангиогенина
УЕСЬ вазоэндотелиальный фактор роста
УБвРЯ рецептор вазоэндотелиального фактора роста
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Терапевтический ангиогенез, который иногда называют биологическим шунтированием, представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации. Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и рсмоделирования кровеносных сосудов. Большое внимание в этом аспекте уделяется теоретическим и практическим разработкам использования клеток мононуклеарной фракции костного мозга МНФ КМ. Это объясняется их уникальным свойством пластичностью, т. Деев Р. В. и др. Волков и др. Агvi . За время, прошедшее после опубликования первой работы по терапевтическому ангиогенезу I . Большие надежды, вызванные многообещающими данными экспериментальных исследований и в основном неконтролируемых клинических исследований, сменились разочарованием после получения результатов масштабных двойных слепых рандомизированных плацебоконтролируемых клинических испытаний, не подтвердивших однозначно эффективность такой тактики i . Более того, в экспериментальном исследовании имплантации несепарированных мононуклеарных клеток МНК КМ в зоны ишемического поражения миокарда собак выявлен рост костных балок в рубцовой зоне Ларионов П. М. и др. После первой публикации Т. МНФ КМ с целью рефляции ангиоваскулогснсза. Появилось множество экспериментальных данных, свидетельствующих об ангиогенной эффективности различных фракций МНК, их сочетаний, генетических модификациях, а также о методах доставки клеток в ишемизированную область. Одним из самых многообещающих методов доставки клеток МНФ в очаг поражения на сегодняшний день является их имплантация в слепые лазерные трансмиокардиальные каналы Ларионов П. М. и др. Большое значение имеет разработка подходов к снижению побочных эффектов клеточной терапии и комбинированному использованию разных методов рсваскуляризации. Это обосновывает актуальность изучения особенностей репаративной регенерации миокарда в условиях хронической ишемии при интрамиокардиальной имплантации различных клеточных популяций МНФ КМ с использованием в качестве объекта эксперимента животного с относительно большой массой тела. Изучить морфологические и иммуногистохимические изменения миокарда собак при моделировании ишемической болезни сердца. Изучить морфологические и иммуногистохимические изменения миокарда в зонах трансмиокардиальной лазерной рсваскуляризации ТМЛР с имплантацией МНК КМ. Оценить цитологические и молекулярные особенности прилипающих и неприлипающих к пластику мононуклеарных клеток костного мозга. Изучить цитологические характеристики имплантированных клеток костного мозга, формирующих сосудистую почку. Основные положения, выносимые на защиту. Клетки мононуклеарной фракции костного мозга обладают ангиогенным и остеогенным потенциалом. Направленная индукция аутологичных клеток костного мозга в культуре является источником эндотелиальных клетокпрсдшсственников. К биологическим особенностям прилипающей и неприлипающей фракций мононуклеарных клеток костного мозга относятся минимальные фенотипические и акцентированные молекулярногенетические различия, что определяет потенциал их использования. Научная новизна. Впервые проведено изучение особенностей структурной реорганизации миокарда собак при моделировании ишемических повреждений и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с использованием иитрамиокардиальной имплантации клеток МНФ КМ. Установлено, что применение интрамиокардиальной имплантации несепарированных клеток костного мозга и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с имплантацией неприлипающей фракции клеток костного мозга в постинфарктный период способствует индукции ангиогенеза в рубцовой и перирубцовой зонах миокарда левого желудочка собак. Выявлены побочные эффекты интрамиокардиальной имплантации несспарированной фракции клеток костного мозга, заключающиеся в появлении очагов эктопической регенерации оссификации, хондрогенеза. Впервые показано, что кратковременное сепарирование на пластике мононуклеарных клеток костного мозга позволяет получить фракции клеток с различным ангиогенным и остеогенным потенциалом.