Регуляция транскрипции генов класса II у инфузории Stylonychia lemnae

• Автор: Пименов, Александр Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 106 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Страница

Список сокращений. .

Введение . .

Глава 1. Обзор литературы. .

1.1 Особенности организации генома инфузорий

1.2 ЗЦЬпусЫа 1етпае удобный модельный объект

для изучения организации генома спиротрих .

1.2.1 Особенности морфологической и ультраструктурной организации макронуклеуса Я 1втпае

1.2.2 Минихромосомы макронуклеуса Я 1етпав

1.3 Регуляция и индукция транскрипции генов класса I эукариотических организмов.

1.3.1 Основные механизмы регуляции транскрипции
генов класса II эукариотических организмов
1.3.2 Регуляция транскрипции генов класса II
у инфузорийслиротрих.
Цель и задачи исследования
Глава 2. Материал и методика.
Объект исследования .
Светооптические методы исследования инфузорий .
Электронномикроскопические методы
исследования инфузорий.
Исследуемые гены .
Олигонуклеотиды
Трансфецирование клеток Б. 1втпав исскуственными
ДНКминихромосомами
Анализ ДНК 1етпав .
Секвенирование .
Фосфорилирование праймеров.
Наращивание плазмид, содержащих исследуемые гены
Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. со.
Подбор праймеров для секвенирования
и обратной транскрипции.
Выделение тотальной ДНК инфузорий.
Пропорциональная ПЦР .
Рестрикция ДНК .
Лигирование фрагментов ДНК .
Обработка ДНК ферментом Кленова .
Стандартная ПЦР.
Оценка интенсивности транскрипции
инъецированных конструкций .
Анализ РНК 1етпав.
Обратная транскрипция
Выделение макронуклеарной РНК инфузорий.
Электрофорез в полиакриламидных гелях
Электрофорез в агарозных гелях.
Определение точки начала транскрипции.
Индукция синтеза тубулина.
Глава 3. Результаты. .
3.1 Светооптические и электронномикроскопические
исследования инфузорий
3.2 Котрансфекция инфузорий 5.1втпав
3.2.1 Котрансфекция инфузорий . 1етпае векторами на основе
минихромосомы, несущей ген а1тубулина
3.2.2 Делеционный анализ 5некодирующего участка
гена а1тубулина.
3.2.3 Анализ 5некодирующего участка гена а1тубулина
с помощью конструкций, несущих нуклеотидные замены
3.3 Определение точек начала транскрипции
3.4 Индукция транскрипции генов а1 и а2тубулина
инфузории 1етпае
3.5 Сравнение экспериментальных данных по строению
промотора гена а1тубулина 1втпав с данными
по другим генам инфузорийслиротрих
Глава 4. Обсуждение,.
4.1 Котрансфекция инфузорий 5. 1етпав .
4.1.1 Котрансфекция инфузорий 1етпае векторами
на основе минихромосомы несущей ген а1тубулина.
4.1.2 Делеционный анализ бнекодирующего участка
гена а1тубулина
4.1.3 Анализ бнекодирующего участка гена а1тубулина с
помощью конструкций, несущих нуклеотидные замены.
4.2 Определение точек начала транскрипции
генов инфузорийспиротрих.
4.3 Индукция транскрипции генов а1 и а2тубулина
инфузории 5.1втпае
4.4 Сравнение экспериментальных данных по строению
промотора гена а1тубулина 8.1етпав с данными
по другим генам инфузорийспиротрих.
Глава 5. Выводы
Список литературы


Такая организация генетического материала наиболее удобна для изучения процессов реализации генетической информации, в том числе и регуляции инициации транскрипции Пименов и др. Действительно, все регуляторные элементы молекулы ДНК, необходимые для корректной инициации транскрипции, сосредоточены в сравнительно короткой лидерной фланкирующей области минихромосомы, что значительно сужает диапазон исследования. Изучение регуляции инициации транскрипции генов класса II у эукариотических организмов привело к созданию классической схемы строения промоторной области , , . Так, для генов класса I СААТбокс и ТАТАбокс в положениях 00 и п. В настоящей работе мы придерживаемся классификации, согласно которой тип ii включает класс ii, содержащий отряды iii род i и род xii i и ii род , класс i род и класс род i , , . При зтом представителей отрядов iii и ii исторически принято объединять в группу брюхоресничных инфузорий, поэтому, говоря о родах i, xii i и , мы будем использовать в равной степени термины брюхоресничные инфузории и инфузорииспиротрихи. Одновременно с этим, изучение представителей типа ii привело исследователей к выводам об отсутствии в генах класса II этих организмов описанных классических элементов регуляции . Причина этого заключается в том, что основным методом большинства исследователей служил теоретический анализ нуклеотидных последовательностей различных генов с целью поиска уже известных регуляторных нуклеотидных последовательностей в их классических положениях так называемый сравнительномолекулярный метод Пименов и др. i, , i, i, , i . i, . При этом экспериментальная проверка соответствующих областей минихромосомы отсутствовала, что ставит под сомнение все выводы, сделанные исследователями. Появившееся в литературе большое количество противоречивых данных относительно состава основного промотора генов класса II представителей типа ii дало толчок к разработке экспериментальных подходов в изучении рассматриваемого вопроса Пименов и др. Так, научноисследовательской группой, в которую входит автор настоящей диссертации, с использованием инфузорииспиротрихи i в качестве модельного объекта, был разработан метод котрансфекции инфузорий мутантными векторами, содержащими делеции и нуклеотидные замены в интересующих участках 5некодирующей области гена, что позволяет с точностью локализовать присутствующие регуляторные последовательности ДНК vi . С использованием рассматриваемого метода был частично проанализирован промотор гена ос1тубулина . iv . i . Райхель, Пименов и др. vi, iv . Были найдены такие классические элементы регуляции как СМТбокс, ТАТАбокс и инициатор, ранее не описанные для генов . При этом инициатор был описан для генов инфузорийспиротрих впервые. К моменту написания настоящей диссертации мы завершили изучение гена а1тубулина . . и других инфузорий на основе анализа данных литературы и собственных результатов. В результате проведенной экспериментальной работы были получены данные, расширяющие представление о механизмах регуляции транскрипции генов класса II представителей типа ii. Впервые для промоторной области гена а1тубулина . СААТбокс, ТАТАбокс и инициатор. Впервые для генов класса II инфузорийспиротрих на примере гена а1тубулина . ДНК энхансер и репрессор. Впервые для генов класса II инфузорийспиротрих путем экспериментального анализа генов а1 и а2тубулина . Материалы диссертации были представлены на м ежегодном съезде Немецкого протозоологического общества iv , , в двух статьях Пименов и др. vi, iv . Лаборатории цитологии одноклеточных организмов Института цитологии РАН.