Экспрессия маркерного антигена мелкоклеточного рака легких - ганглиозида FucGM1: иммуноморфологическое и иммунохимическое исследование с помощью моноклональных антител

• Автор: Зарайский, Евгений Ильич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 с. : ил.

Оглавление
I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Гликолипиды и гликоконъюгаты как маркеры опухолей

человека. Ганглиозид ЕисСМ 1

Глава 2. Роль ганглиозидов в межклеточных

взаимодействиях.

2.1.Гликосинапс первого типа.

2.2 Гликосинапс второго типа

2.3 Гликосинапс третьего типа

Глава 3. Моноклональные антитела для диагностики

опухолей .
3.1. Опухолеассоциированные антигены в сыворотке
3.2. Локализация опухолей и метастазов.
3.3 Патогистологическая диагностика опухолей
3.4. Иммунотерапия опухолей.
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Глава 4.
4.1. Культивирование клеток.
4.2. Среды и реактивы.
4.2.2.Антигены и моноспецифические антитела к ним
4.2.2.1. ГисСМ1 и другие ганглиозиды
4.2.2.2. Очистка моноклональных антител
4.3. Процедура иммуноферментного анализа ИФА
4.3.1. Непрямой ИФА
4.3.2. Процедура прямого ИФА.
4.3.3. Процедура сэндвич ИФА.
4.4. Определение константы связывания МАТ
4.5. Изотипирование МАТ
4.6. Получение гибридом
4.7. Радиоиммунологическое выявление гликолипидного
антигена на тонкослойных пластинах .
4.8. Хромосомный анализ гибридом против РисСМ 1
4.8.1. Использованные клеточные линии
4.8.2. Культивирование клеток
4.8.3. Сбор клеток и приготовление хромосомных препаратов
4.8.4. Окраска хромосомных препаратов.
4.9. Иммуноморфологические исследования.
4 Статистическая обработка результатов .
IV. Результаты собственных исследований.
Глава 5. Получение и исследование МАТ против
ганглиозида ГисСМ1.
5.1. Тестирование иммунного ответа мышей
5.2. Получение гибридом.
5.3.Тестирование моноклональных антител методом ИФА
5.4. Характеристика моноклональных антител 7
5.4.1. Изотипирование МАТ.
5.4.2. Измерение концентрации МАТ.
5.4.3. Определение специфичности МАТ против ГисСМ 1 .
5.5. Хромосомный анализ гибридом
Глава 6. Выявление ГисСМ1 в сыворотке крови и тканях
онкологических больных.
6.1. Выявление ГисСМ1 в опухолях легкого.
6.1.1. Анализ ганглиозидного состава опухолей легкого.
6.1.2. Иммунофлуоресцентное исследование опухолей и других РисвМ
содержащих тканей.
6.2. Исследование РисСМ в сыворотке больных раком
легкого.
6.2.1. Радиоиммунохроматографический анализ РисбМ в сыворотке больных мелкоклеточным раком легких.
6.2.2. Фукозилтрансферазная активность сывороток больных мелкоклеточным раком легких
6.3. Разработка клеточного ИФА с МАТ против ганглиозида БисСМ.
6.3.1. Антилипидные и антиГисСМ1 антитела в сыворотке больных
мелкоклеточным раком легкого
V. ОБСУЖДЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ.
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
I. ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность


Принципиальное значение имеет обнаруженный факт наличия ганглиозида ГисСМ в сыворотке крови больных мелкоклеточным раком легкого. Теоретическая ценность этого наблюдения состоит в том, что до сих пор неизвестны специфические маркеры мелкоклеточного рака легкого в сыворотке крови. Новым фактом является обнаружение антител к антигенам, содержащим терминальную фукозу, в сыворотке крови обследованных онкологических пациентов. Это указывает на связь злокачественной трансформации с аномальным фукозилированием, что в свою очередь может быть обусловлено изменением активности возможно связанной с мутациями специфических фукозилтрансфераз. Практическая ценность работы заключается в получении МАТ против ГисСМ, которые могут служить инструментом для создания серологических и иммуноморфологических диагностикумов для выявления мелкоклеточного рака легкого. Клеточные основы противоопухолевого иммунитета. Москва, XVIII i I, . Расширенном заседании Ученого совета НИИ МЧ РАМН, г. Публикации. Основные положения диссертации изложены в печатных работах. Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов введения, обзора литературы 3 главы, материал и методы 1 глава, результаты собственных исследований 2 главы, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы. Указатель литературы содержит 0 источников, из них отечественных и 0 иностранных. II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 1. Гликолипиды и гликоконьюгаты как маркеры опухолей у человека. Ганглиоэид ГисЗМ1. В последние годы появились многочисленные доказательства связи аномальной регуляции экспрессии генов молекул клеточной поверхности со злокачественной трансформацией1. Дефекты генной регуляции могут приводить к блокаде или отклонениям в синтезе и архитектуре молекул, покрывающих клеточную мембрану. Значительная часть онкомаркеров оказалась представленной гликоконьюгатами. В основном они относятся к новому классу хорошо химически дифференцируемых веществ гликосфинголипидам. Следствием исследования гликосфинголипидов было появление нескольких революционных технологий. Это, вопервых, разделение мембранных ганглиозидоз с помощью высокоэффективной хроматографии с использованием самых современных приемов химического анализа, вовторых, появление гибридомной техники для создания моноклональных антител и, наконец, втретьих, иммуноанализ ганглиозидов на тонкослойных силикагельных пластинах1. Ганглиозиды представляют собой гликолипиды, состоящие из трех частейолигосахарида, спирта сфингозина и нескольких жирных кислотрис. Рис. Структура несколькмх наиболсс распространешьх ганглиозидов. О 1 уу И. Улеводиая част. Состав жирной части молекулы насыщенность или ненасыщенность жирных кислот и их длина оказывают важное влияние на экспрессию углеводной части. Углеводная же часть ганглиозида оказывает важнейшее влияние на взаимодействие между клетками 2. Количество и организация гликолипидов в мембранах и их взаимодействие со специфическими лигандами определяются не только соответствием их своей генетической основе, но также находятся под эпигенетическим контролем. Кроме того, композиция гликолипидов зависит от стадии клеточного цикла, а также клеточных контактов. Зачастую экспрессия ганглиозидов отражает стадии дифференцировки и онкотрансформации . Нарушение метаболизма сфинколипидов и, в частности ганглиозидов, ведет к тяжелым поражениям организма, называемым ганглиозидозами табл. Показано, что экспрессия ганглиозидов соответствует профилю генных изменений при различных видах злокачественной трансформации 1 . В последние годы были проведены исследования нескольких десятков новых гликосфинголипидов. В соответствии с этим происходит процесс классификации и упорядочения ранее исследованных образцов гликолипидов из трансформированных клеток и опухолей. Таблица Слабоумие. КОЖИ Умственная отсталость, увелнчениепеченм. Те же. СсгсОа1 ва Цсрамидлзктозидли ста гая КХ0зПагь тСсгОа Обозначения УеуДЕ Vн. Ссг чеоамид Щ Умственная отсталость и психические нарушения у взрослых ле.