Изучение структурных и функциональных особенностей организации хроматина в ядрах сперматозоидов человека методом проточной цитометрии

• Автор: Семенова, Елена Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 193 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Динамические изменения структуры хроматина ядер сперматозоидов в процессе

созревания и оплодотворения сперматогенез образование мужского иронуклеуса

1.1.1. Сперматогенез.

1.1.2. Характеристика протаминов. Модели взаимодействий ДНК

протаминыЮ

1.1.3. Дальнейшая стабилизация структуры хроматина в ядрах спсрмиев.

1Л .4. Структурная организация суперкомнактного хроматина.

1.1.5. Структуры высших порядков организации хроматина и архитектура ядра сперматозоида

1.1.6. Оплодотворение. Реорганизация хроматина при образовании мужского пронуклеуса

1.2. Возмущающие воздействия в сперматогенезе окислительный стресс и
температурный дисбаланс.
1.2.1. Окислительный стресс.
1.2.2. Температурный дисбаланс
1.3. Техника проточной цитофлуориметрии и е использование для изучения
состояния хроматина.
1.3.1. Проточноцитометрические исследования упаковки хроматина
1.3.2. Изучение состояния хроматина ядер сперматозоидов с помощью техники
проточной цитометрии.
1.4. Ядерпыс протсазы и их роль в структурной организации хроматина
1.4.1. Ядерные протсазы млекопитающих
1.4.2. Ядерные протеазы мужских половых клеток.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Проточные цитометры.
2.2. Приг отовление образцов для проточноцитометричсского анализа
2.2.1. Стандартная процедура окрашивания клеток бромистым этидием и обработка гепарином
2.2.2. Обработка ядер сперматозоидов БНсодержащими реагентами и различными ингибиторами протеаз
2.3. Процедура лечения бесплодия в программе ЭКО.
2.4. Процедура визуализации эндогенной ядерной протеазы сиермиев человека
2.4.1.1 риготовление флуоресцентно меченого ингибитора трипсина соевых бобов
2.4.2. Обработка сперматозоидов флуоресцентно меченым ингибитором трипсина соевых бобов
2.5. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Проточноцитометрический метод оценки состояния хроматина ядер мужских
половых клеток и результаты лечения бесплодия и программе ЭКО
3.1.1. Разработка количественного метода регистрации плотности упаковки
хроматина в ядрах сперматозоидов с помощью техники проточной
цитометрии.
3.1.2. Проточноцитомстрический критерий опенки состояния хроматина ядер сперматозоидов человека тест на фертильность.
3.1.3. Модифицированная математическая модель обсчета и представления проточноцитометрических данных с использованием асимметрий
рас 1 ре дел ен ия
3.1.4. Оценка методом проточной цитометрии эффективности очистки сперматозоидов в программе ЭКО.
3.1.5. Влияние состояния хроматина сперматозоидов на динамику развития эмбрионов человека.
3.2. Обнаружение и исследование эндогенной протсолитичсской активности в ядрах
сперматозоидов человека.
3.2.1. Проточноцитомстрический анализ факторов, вызывающих
деком пактизацию хроматина мужских половых клеток.
3.2.2. Демонстрация ядерной локализации исследуемой протеолитической активности сперматозоидов человека
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Влияние состояния хроматина сперматозоидов человека на результаты
процедуры экстракорпорального оплодотворения.
4.1.1. Существующие методы оценки функционального состояния мужских половых клеток
4.1.2. Основные причины аномальной организации хроматина ядер мужских половых клеток
4.1.2. Доказательства взаимосвязи нарушений организации хроматина в ядрах сперматозоидов и мужского бесплодия.
4.1.3. Преимущества и недостатки разработанного нами способа диагностики мужского бесплодия
4.1.4. Оптимизация процедуры оплодотворения в культуре на основании результатов проточноцитометрического анализа
4.1.5. Участие отцовского генома в раннем эмбриональном развитии.
Негативное влияние аномалий в структурной организации хроматина сперматозоидов на динамику этого процесса.
4.2. Возможное участие эндогенной протеолитической активности спермиев человека в
реорганизации хроматина при формировании мужского пронуклеуса
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Хелаты с металлами в ядрах мужских половых клеток млекопитающих образуются при участии протамина Р2, хотя гистидины и цистеины, входящие в его состав не формируют характерную для многих ДНКсвязывающих белков структуру типа цинковых пальцев . Свойство спермиев выбрасывать кальмодулин регуляторный белок, участвующий в Сазависнмых процессах во многих эукариотических клетках, в окружающую среду при капацитации . Са2 в динамической организации хроматина сперматозоидов. Тяжелые металлы, в частности свинец, вызывают изменения в уровне конденсации хроматина зрелых сперматозоидов человека, уменьшая афинность протамина Р2 к ДНК, и, следовательно, негативно влияют на оплодотворяющий потенциал В. V . Таким образом, в ряде вышеперечисленных работ постулируется, что завершающим этапом формирования хроматина зрелых спермиев является окисление протаминовых молекул. Причем, неполное их окисление может значительно снижать мужскую фертильность . Н. , . В опытах на мышах было показано, что инъекции метансульфоната агента, алкилирующего тиолы дистабилизируют структуру хроматина удлиненных хроматид и зрелых спермиев, вызывая разрушение хромосом и возникновение мутаций . Что касается роли носттрансляционной модификации белков в конформационных изменениях хроматина в ходе сперматогенеза, то в литературе такая информация практически отсутствуют. Известно, что ацетилированис гистонов происходит по лизииовым остаткам в концевой области молекулы, находящейся в непосредственном контакте с ДНК в нуклеосомах соматических клеток и приводит к разрыхлению связей ДНК гистои М. Логичными, поэтому, представляются данные об исключительно низком ниже, чем в грапскрипциоино неактивном, нереплицирующс. Н2В в хроматине спермиев X vi . С другой стороны, в спермиогенезе радужной форели было зафиксировано гиперацетилирование гистона Н4 М. С конденсацией хроматина соматических клеток в частности, в митозе коррелирует, как известно, уровень фосфорилирования гистонов К. Что касается мужских гамет, то, как уже упоминалось, на стадии ранних сперматид протамины фосфорилированы фосфорилированные участки способствуют нахождению правильной конформации взаимодействующих молекул ДНК и белка . ДНК происходит дефосфорилирование протаминов, приводящее к дополнительной конденсации ДНК дефосфорилирование увеличивает общий положительный заряд молекулы нротамина, нейтрализующий отрицательный заряд ДНК, что позволяет соседним спиралям ДНК располагаться максимально плотно . Кроме того, обнаружено дефосфорилирование концевых участков некоторых спермийспецифических гистонов на стадии поздних сперматид С. Гилберт, . Однако, гораздо больше известно о роли фосфорилирования в реорганизации хроматина после оплодотворения. Кроме модификаций сперминспецифических белков в организации и функционировании хроматина важное место занимают изменения, возникающие в нуклеиновых кислотах, и, в первую очередь, это относится к метилированию цитозина при конденсации ДНК . Было показано, что при прохождении сиермиев через эпидидимис структурные перестройки хроматина сопровождаю гея изменением статуса метилирования некоторых генов М. Очевидно, что мстилазы должны быть внутри ядра, однако активация этих энзимов происходит в какойто, пока неустановленной области эпидидимиса . Т. . Резюмируя вышесказанное, следует подчеркнуть, что ДНК в зрелых спермиях млекопитающих упакована протаминами в исключительно компактную, почти кристаллическую структуру. Хроматин спермиев сконденсирован приблизительно в 7 раз более плотно, чем высококонденсированный хроматин метафазных хромосом соматических клеток . Т. . При такой плотности упаковки ДНК минимизируется занимаемый ею объем, не удивительно, поэтому, что ядра сперматозоидов мыши, например, в раз меньше, чем ядра соматических клеток. Ни у кого не вызывает сомнения существование иерархических уровней ядерной организации соматических клеток. Это относится как к структуре хроматина нуклеосомы фибриллы петельные домены, так и к уровням организации более высокого порядка хромосомы не случайно расположены в ядре, но образуют отчетливо различимые локусы Р.