Центросомальные и свободные микротрубочки в цитоплазме культивируемых клеток

• Автор: Чернобельская, Ольга Аркадьевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 188 с. : ил.

Введение

Обзор литературы

Микротрубочки компонент цитоскелета животной клетки

Строение микротрубочек

Полярность микротрубочек

Динамическая нестабильность микротрубочек

Регуляция динамической нестабильности

Тредмиллинг

Митостатические агенты

Динамичные и стабильные микротрубочки

Функции микротрубочек в интерфазе

1. Движение органелл по микротрубочкам
2. Участие микротрубочек в поддержании полярности клетки
3. Участие микротрубочек в поддержании архитектуры клетки
Центросома, ее роль в жизнедеятельности клетки
Строение центросомы
Белки центросомы
1.уТубулин
Участие центросомы в организации системы микротрубочек
Свободные микротрубочки
Происхождение свободных микротрубочек
1. Отсоединение микротрубочек от центросомы
2. Разлом предсуществуюших микротрубочек
3. Нуклеация на нецентросомальных сайтах
4. Полимеризация микротрубочек в цитоплазме
Организация нецентросомальных микротрубочек
Механизм нуклсацни микротрубочек
Контроль нуклеации микротрубочек в цитоплазме
Методы исследования системы микротрубочек в интерфазной
животной клетке
Цитопласты получение и основные свойства
Микротрубочки и центросома в цитопласте
Длина микротрубочек в культивируемых клетках
Цели и задачи работы
Материалы и методы
Клеточная культура
Прижизненные наблюдения
Антитела
Иммунофлуоресцентные исследования
Видеомикроскопия
Электронная микроскопия
Анализ распределения длин микротрубочек
Анализ пространственного расположения микротрубочек
Получение цитопластов
Экспериментальные воздействия
Измерение длин микротрубочек в цитоплазме клетки
Анализ интенсивности флуоресценции тубулина
Анализ сальтаторных движений гранул в живой клетке
Микроинъекция
Частичное фотообесцвечивание
Анализ параметров динамической нестабильности микротрубочек Результаты
1. Анализ системы микротрубочек в фиксированных клетках V Качественный анализ расположения микротрубочек на
злектронномикроскопическом уровне
Центросомальные микротрубочки на электронномикроскопическом уровне
Свободные микротрубочки на электронномикроскопическом уровне
Анализ пространственного расположения микротрубочек
Количественный анализ свободных микротрубочек на световом
уровне в целых клетках
Цитопласты
Морфология цитопластов
Влияние процесса центрифугирования на систему микротрубочек
Система микротрубочек в цитопластах, содержащих центросому
Исследование динамики восстановления свободных и связанных
с центросомой микротрубочек после воздействия холода Исследование динамики восстановления свободных и связанных
с центросомой микротрубочек после воздействия нокодазола Оценка восстановления сети микротрубочек по изменению
интенсивности флуоресценции.
2. Анализ системы микротрубочек в живых клетках
Динамические характеристики центросомальных микротрубочек
Динамические характеристики свободных микротрубочек
Анализ траекторий сальтаторных движений гранул в живых
клетках и цитопластах обоих типов Обсуждение результатов
Методы исследования системы микротрубочек в клетках, их
преимущества и недостатки
Цитопласт как модель для исследования системы микротрубочек
в в цитоплазме клеток адекватность модели
В клетках УЕ1Ю присутствуют многочисленные короткие, не
связанные с центросомой микротрубочки
Происхождение свободных микротрубочек.
Динамические характеристики центросомальных и
свободных микротрубочек во внутреннем объеме цитоплазмы.
Роль центросомальных и свободных микротрубочек в поддержан и к 3 формы клетки, организации ламеллы и сальтаторных движениях Динамика восстановления центросомальных микротрубочек.
Динамика восстановления свободных микротрубочек.
Двухфазное восстановление сети микротрубочек.
Выводы
Список литерату


Считается, что перечисленные белки образуют сложный комплекс на плюс конце микротрубочки v . На минус конце микротрубочкн локализуется утубулин, катании и нинеии ii. V . Катании белок, способный разрезать микротрубочки, который участвует в отсоединении микротрубочек от центросомы . Таким образом, полярность микротрубочек определяется не только наличием а или тубулина на ее конце, но и специфическими белками, которые могут связываться с одним из концов микротрубочки и влиять на их свойства. В современной литературе поведение микротрубочек в животной клетке принято описывать в терминах динамической нестабильности. Явление динамической нестабильности было впервые описано Митчисоном и Киршнером ii, i в году. Было показано i vi, что микротрубочки в равновесном состоянии не являются статичными структурами их концы находятся в состоянии постоянного роста или укорочения ii, i, . После включения димера тубулииа в состав микротрубочки происходит гидролиз , связанного с тубулином, до и . Молекулы тубулина, несущие , прочнее связываются с концом микротрубочки имеют большее сродство и имеют меньшую константу диссоциации. При быстром росте микротрубочки происходит запаздывание гидролиза, поэтому на быстро растущем конце образуется шапочка из тубулина, препятствующая разборке и способствующая росту микротрубочки. При уменьшении скорости роста происходит полный гидролиз на тубулине, и микротрубочка начинает укорачиваться i . Таким образом, динамическая нестабильность микротрубочек это чередование фаз роста полимеризации и укорочения деполимеризации концов микротрубочки ii, i, . В отличие от системы i vi, в живых клетках концы микротрубочек могут расти и укорачиваться, а также могут находиться
в неподвижном состоянии, получившем название пауз ii, i, i . Если продолжительность фазы роста преобладает над фазой укорочения, то конец микротрубочки растет и наоборот. С усовершенствованием техники прижизненных наблюдений, с использованием методики инъекций флуоресцентно меченого тубулина, стало возможно исследовать динамику микротрубочек в живых клетках а. Было показано, что фазы роста и укорочения концов микротрубочек длятся по несколько десятков секунд и, как правило, продолжаются на небольшие расстояния 1,3 мкм в клетках и 3,2 мкм в клетках СНО, а переход от роста к укорочению носит случайный характер . В разных работах, выполненных на различных объектах, время полуобмена отдельной микротрубочки варьирует от 5 до мин x . Таким образом, каждая микротрубочка в клетке находится в состоянии динамической нестабильности, живет недолго и довольно быстро разбирается и заменяется новой. Динамические свойства концов микротрубочек могут изменяться на протяжении клеточного цикла. Так, наблюдается существенная разница между динамикой и длиной микротрубочек в интерфазной клетке и митотическом веретене. В интерфазной клетке количество микротрубочек значительно меньше, чем в митозе , I, i, i, а их средняя длина значительно выше i, ii . Регуляция динамической нестабильности играет важную роль в функционировании системы микротрубочек. Скорость сборки микротрубочек i vi в несколько раз меньше, чем их скорость роста i viv. Это связано с тем, что в клетке присутствуют многочисленные молекулы, связывающиеся с микротрубочками, которые могт регулировать динамику микротрубочек. Прежде всего, это уже упоминавшиеся белки семейства . Например, белок МАР2 подавляет динамическую нестабильность микротрубочек, а белок ХМАР наоборот, стимулирует . В нескольких работах было показано, что 8i, небольшой термоустойчивый белок, связывающийся с двумя тубулиновыми димерами, увеличивает частоту катастроф, вызывая гидролиз ii, i . Сейчас этот белок активно исследуется, поскольку показано, что он может играть определенную роль в опосредовании локальных изменений в динамике микротрубочек в митозе. Показана его локализация в непосредственной близости от хроматина при сборке веретена . В настоящее время известно, что это полифункциональный белок, преобладание того или иного механизма, действия которого зависит от среды.